Модель ишемизированной длительно незаживающей раны: регенерация после трансплантации живого эквивалента кожи

Введение

В норме процесс регенерации кожного повреждения завершается полным восстановлением структуры и функций кожи, однако в случае присоединения инфекции, гипоксии или иммунной дисфункции рана может приобрести статус длительно незаживающей [1]. Такие раны характеризуются избыточным воспалением, повышенным уровнем протеолитической активности и уменьшением отложения матрикса [2]. Стадии регенерации длительно незаживающей раны соответствуют ранозаживлению в норме, однако со значительной задержкой в фазе воспаления [3]. К факторам, вызывающим хронизацию раны, относят диабет, сосудистую недостаточность, истощение, пожилой возраст, местную инфекцию, а также некроз вследствие сдавливания [3, 4]. В зависимости от генеза заболевания выделяют такие типы длительно незаживающих ран, как пролежни, диабетические язвы и ишемизированные длительно незаживающие раны. Последние трудно поддаются консервативной терапии.

Одним из перспективных направлений в лечении длительно незаживающих ран является трансплантация биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) типа кожных эквивалентов. Такое лечение способствует эффективному ремоделированию грануляционной ткани и устранению косметического дефекта — одного из последствий хронизации ран [5]. Разработка модели ишемизированной длительно незаживающей раны, адекватной человеческой патологии, — не­отъем­лемая часть исследований, направленных на создание БМКП. Особенности строения, отличающие кожу лабораторных животных от кожи человека, вызывают сложности в создании схожих моделей ишемизированных длительно незаживающих ран [6]. Для приближения процесса регенерации в модели животного к человеческой патологии исследователи неред­ко используют синтетические конструкции и материалы, что, однако, снижает адекватность моделей. Например, наличие швов в непосредственной близости к ране вызывает значительный фон при проведении работ, поэтому возникают трудности с интерпретацией результатов. Все это является одной из причин наличия широкого разнообразия моделей ишемизированных длительно незаживающих ран на лабораторных животных [7]. На данный момент в России запатентовано несколько моделей длительно незаживающих ран, однако модели, которая бы полностью подходила для проведения доклинических исследований БМКП, нет.

Цель исследования — оценить возможность использования разработанной в нашей лаборатории модели ишемизированной длительно незаживающей раны для доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов при трансплантации тканеинженерной конструкции.

Задачи исследования: проведение эксперимента по трансплантации тканеинженерной конструкции «живой эквивалент кожи» (ЖЭК), представляющей собой эпидермально-мезенхимный пласт на носителе; подбор методов для определения эффективности лечения ишемизированных длительно незаживающих ран во время доклинических исследований на предложенной модели.

Материалы и методы

Клеточные культуры. Для приготовления ЖЭК использовали клеточные культуры кератиноцитов и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из УНУ «Коллекция клеточных культур для биотехнологических и биомедицинских исследований (общебиологического и биомедицинского направления)» Института биологии развития им. Н.К. Кольцова. Кератиноциты культивировали на среде DMEM/F-12 («ПанЭко», Россия) в соотношении 1:1 c 10% фетальной бычьей сывороткой (ФБС) (HyClone, США), 5 мкг/мл инсулина (Sigma-Aldrich, США), 10-6М изопротеренола (Sigma-Aldrich), 5 мкг/мл трансферрина (Sigma-Aldrich), 10 нг/мл EGF (Sigma-Aldrich) и 1% пенициллина–стрептомицина (Gibco, США). МСК культивировали на среде DMEM («ПанЭко»), содержащей 10% ФБС (HyClone), 1% глутамина (Gibco) и 1% пенициллина–стрептомицина (Gibco).

Для изготовления биологического эквивалента кожи (ЖЭК)на коллаген-гиалуроновой пленке кокультивировали кератиноциты и МСК мыши. Клетки на носителе были готовы к этапу переноса в рану через 2–3 сут.

Работа с животными. Все манипуляции с животными осуществляли под общим наркозом в соответствии с «Правилами для проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Россия, 2010) и «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (CIOMS и ICLAS, 2012), неукоснительно соблюдали этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006). Исследование одобрено Комиссией по биоэтике Института биологии развития РАН (протоколы №23 от 15.11.2018 и №28 от 05.09.2019). Животные содержались при свободном доступе к корму и воде. В исследовании использовано 56 мышей линии BALB/c.

Для проведения исследований мыши были разделены на группы «контроль» (n=19), «носитель» (n=19) и «ЖЭК» (n=18). Перед манипуляциями животных вводили в состояние общего наркоза при помощи препарата авертин. Шерсть в области операционного поля удаляли кремом для депиляции (Veet, Канада). После депиляции на кожу мышей наносили прямоугольник 30×10 мм, по центру которого вырезали полнослойное циркулярное отверстие диаметром 5–7 мм. Затем по начерченным линиям мышам выполняли полнослойные параллельные разрезы кожи и отсекали от лоскута все крупные сосуды. Далее останавливали кровотечение с помощью нанесения на лигированые сосуды перекиси водорода. После этого на края лоскута наносили швы, промывали рану и накладывали пластырь Tegaderm^TM (Германия).

Трансплантацию носителя и ЖЭК в соответствующих группах проводили путём аппликации этих материалов на раневое ложе животных. После операции накладывали пластырь Tegaderm^TM.

На 3–5-е сутки мышам групп «контроль», «носитель» и «ЖЭК» промывали раны при помощи стерильного 0,1% раствора гентамицина на DPBS («ПанЭко»). Животных выводили из эксперимента на 5-, 7-, 14-, 21-е сутки путем передозировки наркоза.

Пробоподготовка биоматериала. Биоматериал, предназначенный для гистологических исследований, фиксировали в 10% формалине (Biovitrum, Швеция). Биоматериал, предназначенный для иммуногистохимических исследований, помещали в гель ОСТ Cryomount (HistoLab, Швеция) и замораживали в жидком азоте.

Гистологическое исследование. Для гистологических исследований использовали материал, заключенный в парафиновые блоки. Гистологические срезы получали на микротоме Microm HM 430 (Thermo Fisher Scientific, США). Препараты были окрашены гематоксилином–эозином и трихромом по Маллори.

Иммуногистохимическое окрашивание. Крио­сре­зы подготавливали по стандартной методике на криостате CM1900 (Leica Microsystems, Германия). Для фиксации использовали 4% параформальдегид. Блок-раствор, на котором разводили антитела, содержал 5% сыворотку животного-продуцента вторичных антител. С первичными антителами препараты инкубировали на протяжении ночи. Далее на препараты наносили вторичные антитела, раствор DAPI и заключали в среду BrightMount/Plus (Abcam, Великобритания). В работе использовали первичные моноклональные антитела кролика против Krt14 (1:200; Ab197893; Abcam) и первичные моноклональные антитела крысы против CD31 (1:100; Ab56299; Abcam), а также вторичные антитела козы против крысы AlexaFluor 488 (1:600; Ab150157; Abcam) и вторичные антитела осла против кролика AlexaFluor 488 (1:500; A-21206; Invitrogen, США).

Препараты просматривали и фотографировали при помощи микроскопов моделей BZ-9000E (Keyence, Япония) и IX73 (Olympus, Япония).

Растровая сканирующая оптоакустическая мезоскопия. Исследование динамики процесса заживления раны выполняли с помощью мезоскопа RSOM Explorer P50 (iThera Medical, Германия).

Морфометрия и статистический анализ. Морфометрический анализ проводили с помощью программы ImageJ. Статистический анализ выполняли в программе Excel, а также с применением программирования R в среде R studio. Для сравнительного анализа данных использовали непараметрический тест для множественных сравнений по Краскелу–Уоллису. Сравнения между группами проводили с помощью теста Данна. Различия считали статистические значимыми при p≤0,05.

Результаты и обсуждение

В предварительных экспериментах нашей лаборатории разработана модель длительно незаживающей раны, которая воспроизводила условия ишемии и была адекватна человеческой патологии [8]. Однако она имела недочеты, что технически препятствовало проведению исследований, связанных с доклиническими испытаниями БМКП. Так, при формировании лоскута наблюдалось обильное кровотечение в раневое ложе, а на 7–14-й день эксперимента раны нагнаивались. Кроме того, разработанная модель раны не имела покрытия, которое бы предохраняло БМКП в раневом ложе. Поэтому были выполнены процедуры по оптимизации модели: купирование кровотечения из лигированных сосудов перекисью водорода, промывание раны стерильным 0,1% раствором гентамицина на DPBS во время операции и во время послеоперационного ухода, а также наложение пластыря Tegaderm^TM (см. таблицу).

Негативные факторы для проведения доклинических испытаний биомедицинских клеточных продуктов, возникающие при моделировании ишемизированной длительно незаживающей раны, и способы их решения в предложенной модели

С целью оценки приемлемости предложенной модели для испытаний БМКП был проведен эксперимент, включающий трансплантацию тканеинженерной конструкции ЖЭК или трансплантацию носителя, выдержанного в таких же условиях, что и ЖЭК. Мышам группы «контроль» трансплантацию не выполняли. Раны мышей всех групп закрывали пластырем Tegaderm^TM.

В качестве методов, позволяющих оценить эффективность лечения ишемизированных длительно незаживающих ран во время доклинических исследований на предложенной модели и сравнить состояние ран, были выбраны гистологический, иммуногистохимический, а также метод растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии (РСОМ).

Характеристика раневого процесса методами гистологии и иммуногистохимии

Гистологический анализ показал, что фаза воспаления в вышеописанной модели длится до 5 сут с момента нанесения раны. На этой стадии раневое ложе мышей всех групп характеризовалось инфильтрацией воспалительными клетками. Далее следовала фаза пролиферации — 7–14-е сутки ранозаживления. Во время этой стадии отмечено постепенное формирование грануляционной ткани в раневом ложе. На 21-е сутки наступала фаза реэпителизации и ремоделирования рубца. Большинство ран животных всех групп характеризовалось зрелым рубцом и наличием сформированного эпителия. Проведенный гистологический анализ позволил подробно охарактеризовать и сравнить состояние ран животных всех групп согласно стадиям ранозаживления. В качестве критериев оценки эффективности лечения раны при помощи БМКП предложены следующие параметры: васкуляризация раневого ложа, инфильтрация воспалительными клетками раневого ложа, состояние зоны ремоделирования ткани в раневом ложе, а также количество волосяных фолликулов (ВФ) по краям раны [9].

Стадия воспаления

Как уже было сказано выше, задержка раневого процесса на фазе воспаления и чрезмерный воспалительный ответ лежат в основе приобретения раной статуса длительно незаживающей [10]. Избыточная инфильтрация раневого ложа нейтрофилами является ключевым фактором в развитии хронического воспаления и может рассматриваться в качестве гистологического биомаркера длительно незаживающих ран [4]. На 5-е сутки раневое ложе многих мышей из группы «контроль» было заполнено воспалительным инфильтратом. Отмечена миграция воспалительных клеток в жировую ткань и соедительнотканную фасцию под раневым ложем и по краям раны. Кроме того, обнаружены существенная деградация эпидермиса и дермы по краям раны, а также участки погибших клеток (рис. 1, б). Раны многих мышей из группы «носитель» имели схожую гистологическую картину (рис. 1, в). В то же время у большинства мышей из группы «ЖЭК» наблюдалась умеренная инфильтрация раневого ложа, жировой ткани и фасции всей раневой области воспалительными клетками (рис. 1, г). Сравнение исследуемых групп продемонстрировало тенденцию к снижению площади воспалительного инфильтрата раневого ложа мышей группы «ЖЭК» (рис. 1, а). Исходя из этого, можно сделать предположение об иммуномодулирующем эффекте ЖЭК благодаря наличию в его составе МСК.

Рис. 1. Регенерация длительно незаживающей раны на стадии воспаления: а — площадь воспалительного инфильтрата в группах «контроль», «носитель» и «ЖЭК»; состояние раны мыши на 5-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: б — «контроль», в — «носитель», г — «ЖЭК»

Стадия пролиферации

Грануляционная ткань. В период пролиферации происходило созревание грануляционной ткани у мышей всех групп. Однако отмечен ряд существенных различий в формировании грануляционной ткани у мышей из группы «контроль» и мышей из группы «ЖЭК».

Как известно, длительно незаживающая рана характеризуется нарушениями формирования грануляционной ткани по разным причинам. Например, сверхпродукция нейтрофилами активных форм кислорода вызывает повреждения внеклеточного матрикса [4]. Предполагают также, что нормальному рубцеванию препятствует TNF-α, индуцирующий активность коллагеназы [11–13].

В группе «контроль», имитирующей длительно незаживающую рану без лечения, у большинства животных на гистологических препаратах ран была отмечена большая разница между толщиной дермы по краям и толщиной зоны ремоделирования ткани по центру раны. Края раны значительно возвышались над раневым ложем на 7-е сутки эксперимента (рис. 2, б). В группе «носитель» наблюдалась схожая картина (рис. 2, в). В группе «ЖЭК» на 7-е сутки у большинства животных толщина зоны ремоделирования ткани в раневом ложе практически достигала краев раны (рис. 2, г).

Рис. 2. Регенерация длительно незаживающей раны на стадии пролиферации: коэффициент сглаживания в группах «контроль», «носитель» и «ЖЭК» на 7-е (а) и 14-е сутки (д), * p≤0.05; состояние раны мыши на 7-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: б — «контроль», в — «носитель», г — «ЖЭК»; состояние раны мыши на 14-е сутки, окрашивание по Маллори: е — «контроль», ж — «носитель», з — «ЖЭК»

На 14-е сутки у многих животных из группы «конт­роль» толщина зоны ремоделирования ткани все еще была значительно меньше толщины дермы краев раны (рис. 2, е), в группе «носитель» толщина зоны ремоделирования ткани частично или полностью достигала краев раны (рис. 2, ж), а в группе «ЖЭК» у большинства животных зона ремоделирования ткани полностью заполняла раневое ложе по ширине и высоте (рис. 2, з). Морфологически середина раны у мышей группы «контроль» на 14-е сутки характеризовалась скудным количеством ткани, а в группах «носитель» и «ЖЭК» — обильным; грануляционная ткань в группе «ЖЭК» отличалась хорошо визуализируемыми волокнами. Для описания эффективности лечения при трансплантации ЖЭК в отношении влияния на грануляции введено понятие «коэффициент сглаживания», который определяет отношение толщины зоны ремоделирования ткани раневого ложа к толщине дермы краев ран. В группе «ЖЭК» коэффициент сглаживания был статистически значимо выше, чем таковой в группах «носитель» и «контроль» на 7-е сутки, что свидетельствовало об эффективности трансплантации ЖЭК в устранении дефекта грануляционной ткани, который может привести к косметическим проблемам (рис. 2, а). На 14-е сутки коэффициенты сглаживания в группах «ЖЭК» и «носитель» были статистически значимо выше, чем в группе «контроль», при этом статистически значимо не отличались друг от друга (рис. 2, д).

Состояние ткани по краям ран. Волосяные фолликулы: гибель и регенерация. На 7-е сутки у многих животных всех трех групп продолжались дегенеративные изменения ткани краев ран. Ввиду индивидуальных различий между темпами регенерации наблюдались различные варианты состояния краев ран на данную временнýю точку: умеренная дегенерация интерфолликулярного эпидермиса, дермы и ВФ по краям раны; массовая гибель данных структур с дальнейшим формированием струпа; частичная регенерация ткани. Известно, что регенерация ВФ может происходить в ходе различных процессов: регенерации в случае мик­роповреждения, регенерации в случае утраты части ВФ, раноиндуцированного неогенеза волос, характерного для крупных полнослойных ран грызунов [14], а также раноиндуцированного анагена [15]. В нашей работе определить тип регенерации, в ходе которой происходило восстановление ВФ в процессе заживления ишемизированной длительно незаживающей раны, не представлялось возможным ввиду технических сложностей. В связи с этим мы употребляем термин «регенерация ВФ» без конкретизации ее вида.

В нашем эксперименте отмечены определенные различия в динамике процессов дегенерации, гибели и регенерации ВФ у животных групп «контроль» и «ЖЭК». Так, у многих мышей из группы «контроль» наблюдалась массовая гибель ВФ по краям раны. Клетки ВФ характеризовались выраженными дегенеративными изменениями, а также кариолизисом (рис. 3, б). В то же время в группе «ЖЭК» многие ВФ, расположенные по краям ран, имели либо нормальную морфологию, либо характеризовались умеренными признаками дегенерации (рис. 3, г). Среднее количество ВФ на край раны в группе «ЖЭК» увеличилось по сравнению с группой «контроль». Это может свидетельствовать о том, что ЖЭК способствует сохранению ВФ или ускоряет процесс их регенерации (рис. 3, а).

Рис. 3. Регенерация длительно незаживающей раны на стадии пролиферации: среднее количество волосяных фолликулов на край раны в группах «контроль», «носитель» и «ЖЭК» на 7-е (а) и 14-е сутки (з); состояние края раны мыши на 7-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: б — «контроль», в — «носитель», г — «ЖЭК»; окрашивание антителами к Krt14, ядра докрашены DAPI: д — «контроль», е — «носитель», ж — «ЖЭК»; состояние края раны мыши на 14-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: и — «контроль», к — «носитель», л — «ЖЭК»; окрашивание антителами к Krt14, ядра докрашены DAPI: м — «контроль», н — «носитель», о — «ЖЭК»

На 14-е сутки ВФ большинства ран имели нормальную морфологию; количество ВФ в группах статистически значимо не отличалось. Таким образом, темпы регенерации ВФ во всех трех группах сравнялись (рис. 3, з).

Интенсивность ангиогенеза. Количественный анализ выявил отсутствие статистически значимых различий между плотностью сосудов в раневом ложе у мышей всех трех групп на 7-е сутки. Следовательно, ЖЭК не влияет на ангиогенез (рис. 4).

Рис. 4. Регенерация длительно незаживающей раны на стадии пролиферации: а — плотность сосудов в раневом ложе мышей групп «контроль», «носитель» и «ЖЭК»; состояние раневого ложа мыши на 7-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: б — «контроль», в — «носитель», г — «ЖЭК»; окрашивание антителами к CD31, ядра докрашены DAPI: д — «контроль», е — «носитель», ж — «ЖЭК»

Ремоделирование рубца и реэпителизация. На 21-е сутки большинство ран у животных всех групп характеризовались формированием рубца и реэпителизацией (рис. 5). У многих мышей в рубцовой ткани волокна преобладали над клеточным компонентом, а также наблюдались ВФ в фазе зрелого анагена. Исходя из этого, можно сделать вывод о полной завершенности процесса регенерации раны. Однако у некоторых мышей в раневом ложе клеточный компонент преобладал над волокнами, отмечалась инфильтрация воспалительными клетками, что говорит о незавершенности процесса ранозаживления. Оба варианта ранозаживления встречались у мышей всех трех групп. Таким образом, темпы регенерации в группах на 21-е сутки уравнивались.

Рис. 5. Регенерация длительно незаживающей раны на стадии ремоделирования рубца и реэпителизации: состояние раневого ложа мыши в исследуемых группах на 21-е сутки, окрашивание гематоксилином–эозином: а — «контроль», зрелый рубец с ВФ; б — «носитель», инфильтрация воспалительными клетками, преобладание клеточного компонента над волокнами; в — «ЖЭК», зрелый рубец с ВФ; окрашивание по Маллори: г, ж — «контроль»; д, з — «носитель»; е, и — «ЖЭК»

Характеристика раневого процесса методом растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии

Растровая сканирующая оптоакустическая мезоскопия — новейшая неинвазивная технология, позволяющая получать изображения в высоком разрешении. Для проведения РСОМ осуществляется сканирование интересующего участка кожи при помощи датчика параллельно с освещением пучком оптических волокон. Оптоакустические волны, генерированные в ткани в ответ на пульсирующее освещение, фиксируются; полученное изображение представляет собой трехмерное распространение абсорбированного света в коже. Реконструированные изображения демонстрируют распределение меланина и гемоглобина в эпидермисе и дерме, что позволяет получать изображение микроваскуляторной системы кожи на глубине до 1–2 мм [16].

Поскольку РСОМ успешно используется в исследованиях таких патологий кожи, как псориаз и атопическая экзема [17], в текущей работе данный метод применили для оценки динамики кровотока раны в качестве критерия удачной трансплантации БМКП. Измерения были проведены на 3-, 5-, 7-, 10-, 14- и 21-е сутки. В результате эксперимента установлено, что на 10-е сутки интенсивность сигнала на низких частотах в группе «ЖЭК» статистически значимо превышала таковую в группе «контроль» (рис. 6, г). Данный факт можно интерпретировать в пользу того, что ЖЭК способствует ангиогенезу во время ранозаживления.

Рис. 6. Исследование раневого ложа методом растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии: трехмерная реконструкция сосудов мыши на 21-е сутки в группах «контроль» (а), «носитель» (б) и ЖЭК (в); низкочастотный сигнал представлен красным цветом, высокочастотный — зеленым; интенсивность сигнала на низких (г) и высоких (д) частотах, * p≤0,05

В ходе работы при исследовании раневого ложа с помощью РСОМ возник ряд труднопреодолимых технических сложностей. Так, материал, из которого был сконструирован носитель для клеток ЖЭК, затруднял проведение эксперимента и создавал значительный фон. Кроме того, трансплантат мешал наблюдению за состоянием микроваскуляторного русла под ним, в то время как рана мышей без трансплантации оставалась открытой, из-за чего сравнение полученных результатов представлялось некорректным. Проведению измерений препятствовал не только трансплантат, но и пластырь, снятие которого создавало риск инфицирования раны. Кроме того, во время измерений животное, чей организм испытывал нагрузку из-за кровопотери, продолжительное время вынужденно пребывало в состоянии общего наркоза, что негативно сказывалось на его состоянии и нередко приводило к гибели. Все это позволяет заключить, что РСОМ не может быть рекомендован для оценки эффективности трансплантации БМКП во время доклинических исследований.

Заключение

Изучение регенерационных процессов показало, что предложенная нами модель ишемизированной длительно незаживающей раны является пригодной для доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. Оценка таких параметров, как инфильтрация раны воспалительными клетками, состояние зоны ремоделирования ткани, количество волосяных фолликулов, васкуляризация раневого ложа, согласно соответствующим стадиям ранозаживления, методами гистологии и иммуногистохимии является адекватной и подходит для доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов на изучаемой модели. Кроме того, в работе был предложен новый показатель — коэффициент сглаживания, который, являясь отношением толщины зоны ремоделирования ткани к толщине дермы краев раны, позволил оценить степень заполненности раневого ложа развивающейся тканью. Его высокое значение в группе «ЖЭК» означает, что трансплантация биомедицинских клеточных продуктов влияет на свойства фибробластов, препятствует механическому напряжению в ране и, как следствие, предотвращает формирование косметического дефекта. Данный показатель позволит оценивать состояние зоны ремоделирования ткани в раневом ложе с трансплантацией и без нее и таким образом прогнозировать эффективность биомедицинских клеточных продуктов на предмет устранения косметических дефектов.

Оценка динамики кровотока раны методом растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии не может быть рекомендована для доклинических исследований биомедицинских клеточных продуктов на предложенной модели ввиду ее особенностей.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам Сколковского института науки и технологий д.х.н., профессору Д.А. Горину, к.б.н. М.В. Новосёловой и к.б.н. О.С. Гусляковой за помощь в проведении исследований методом РСОМ.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках Государственного задания ИБР РАН №0088-2021-0016 и поддержана Министерством науки и высшего образования Российской Федерации, соглашение №075-15-2021-1063 от 28.09.2021.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.