Разработка и синтез предшественников радиофармпрепаратов на основе пептида бомбезина, модифицированного с использованием кноттина

Введение

Пептид-рецепторная радионуклидная терапия представляет собой молекулярно-направленную лучевую терапию, включающую системное введение радиоактивно-меченого пептида, предназначенного для воздействия на рецепторы на поверхности опухолевых клеток [1]. Самым крупным классом рецепторов, которые в значительной степени экспрессируются при онкологических заболеваниях, являются рецепторы, связанные с G-белком (гастрин-высвобождающие пептидные рецепторы (gastrin-releasing peptide receptors, GRPR)). Этот класс включает более восьмисот рецепторов, имеющих общую структуру из семи трансмембранных спиралей, которые связаны тремя внутри- и тремя внеклеточными петлевыми областями, внеклеточным N-концом и внутриклеточным карбоксил-концевым доменом [2]. К классу GRPR-рецепторов также относят и семейство бомбезиновых рецепторов [3]. Рецепторы бомбезина широко распространены в организме млекопитающих. Их активация вызывает широкий спектр физиологических реакций: стимуляцию роста нормальных и неопластических тканей, сокращение гладких мышц, пищевое поведение, секрецию и многие эффекты центральной нервной системы, включая регуляцию циркадного ритма [4, 5]. Однако рецепторы бомбезина привлекли внимание исследователей в первую очередь из-за их экспрессии при различных видах рака [6]. Они часто экспрессируются в значительных количествах на клетках опухолей молочной железы, предстательной железы, рака толстой кишки, легких, нейробластомы и других [7–13]. В связи с этим пептид-рецепторная терапия, направленная на рецепторы бомбезина, может служить перспективной основой для лечения широкого спектра онкологических заболеваний.

В основе одной из стратегий, нацеленных на воздействие на бомбезиновые рецепторы, лежит использование тропных коротких пептидов. К ним можно отнести амидированный тетрадекапептид, названный бомбезином по названию лягушки Bombina bombina, из кожи которой он был выделен еще в 1972 г. V. Erspamer и его коллегами [14]. Позже бомбезин-подобные пептиды были обнаружены и у млекопитающих. Из спинного мозга свиньи выделили бомбезин-подобный пептид 1 — BB1 (декапептид нейромедин B, NMB), встречающийся в формах-предшественниках из 30 и 32 аминокислот. Концевые карбоксильные группы NMB идентичны бомбезину, за исключением группы замены валина на треонин в NMB [15]. Из желудка свиньи был выделен бомбезин-подобный пептид 2 — BB2 (гастрин-высвобождающий пептид, GRP) из 27 аминокислот, имеющий те же 7 карбоксильных концевых аминокислот, что и бомбезин, которые обеспечивают схожую биологическую активность [16]. Наконец, был открыт бомбезин-подобный рецептор 3 — BRS3, также известный как рецептор бомбезина подтипа 3, который, однако, на данный момент изучен слабо и для которого не обнаружен природный лиганд [17].

В своей работе мы создали новую, не встречающуюся в природе пептидную конструкцию на основе токсина кноттина, способную к целевому связыванию с бомбезиновым рецептором на поверхности раковых клеток. За основу взяли короткий пептид бомбезин, выделенный из кожи лягушки B. bombina, который модифицировали с использованием токсина с цистиновым ингибиторным узлом. К данному классу токсинов относятся в первую очередь токсины из яда беспозвоночных, одной из отличительных особенностей которых является повышенная протеолитическая и термическая стабильность. В нашем случае был выбран токсин кноттин — U5-scytotoxin-Sth1a (UniProt: U51A_SCYTH) из паука Scytodes thoracica. Выбранный короткий пептид был помещен в положение между первым и вторым цистеиновыми остатками, в связи с чем новая структура получила название BBN/C1-C2. В нашем предыдущем исследовании [18] при работе с пептидом, тропным к простатспецифическому мембранному антигену (PSMA), мы показали эффективность данной стратегии.

Помимо пептидной части в пептид-рецепторной радионуклидной терапии важен выбор радиоизотопа, активность распада которого улавливается в случае визуализации опухоли и обеспечивает уничтожение опухолевых клеток в случае лечения. Одним из перспективных изотопов для использования в радиофармпрепаратах является лютеций. Он имеет короткий период полураспада — около 7 дней, что служит достаточно долгим периодом для транспортировки и хранения, но достаточно коротким, чтобы защитить организм от накопления высоких доз радиации. Лютеций является бета- и гамма-излучателем, что позволяет использовать его как для терапии, так и для визуализации. Энергия бета-частиц обеспечивает идеальное проникновение в мягкие ткани на глубину 670 мкм, достаточную для уничтожения опухолевой клетки, но недостаточную для негативного воздействия на окружающие ткани [19].

Важную роль в пептид-рецепторной радионуклидной терапии играет хелатор, входящий в состав радиофармпрепарата и обеспечивающий связь радио­изотопа с пептидной конструкцией. В нашей работе в качестве радиоизотопа был использован хлорид лютеция ¹⁷⁷Lu. Он имеет степень окисления +3, что облегчает хелатирование иона, и в данном случае является наилучшим кандидатом для наших целей. В качестве хелатора выбран бифункциональный хелатор с макроциклическим ядром — DOTA (2,2′,2′′,2′′′-(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetraacetic acid). Подобные хелаторы способны образовывать высокостабильные металлокомплексы с ионами трехвалентных металлов (Lu³⁺, Ga³⁺), что обусловливает их применение в разработке радиофармацевтических препаратов [20, 21].

Таким образом, при создании нового радиофарм­препарата следует учитывать не только степень связывания его с рецепторами на поверхности опухолевых клеток, но и стабильность, которая проявляется в способности пептидной конструкции оставаться постоянной (химическая стабильность) и удерживать радиоизотоп (радиохимическая стабильность).

Цель исследования — изучить химическую и радиохимическую стабильность структуры на основе короткого пептида бомбезина и токсина кноттина — BBN/C1-C2, а также способность полученной структуры связываться с опухолевыми клетками.

Материалы и методы

Синтез и анализ пептидной конструкции BBN/C1-C2. Модификацию и синтез бомбезина проводили на пептидном синтезаторе ResPep SL (Intavis, Германия) с использованием Fmoc-защищенных аминокислот на смоле TentaGel (Intavis, Германия). Синтез начинали с депротекции аминокислот 20% 4-метилпиперидином (Acros Organics, Бельгия) в диметилформамиде («Кемикал Лайн», Россия). Затем аминокислоты активировали реагентом HBTU (hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium) («Кемикал Лайн», Россия) в присутствии N-метил-2-пирролидона и N-метилморфолина (PanReac AppliChem, Испания). Связывание выполняли с использованием 5% уксусного ангидрида (Sigma Aldrich, США). Основным растворителем во время синтеза выступал диметилформамид. Снятие со смолы проводили смесью из 92,5% трифторуксусной кислоты (PanReac AppliChem, Испания), 5% триизопропилсилана (Acros Organics, Бельгия) и 2,5% деионизированной воды в течение 3 ч при комнатной температуре. Затем пептид осаждали центрифугированием с использованием ледяного трет-бутилметилового эфира («Кемикал Лайн», Россия). В качестве хелатирующего агента для радиоизотопа применяли хелатор DOTA, прикрепление которого происходило в процессе пептидного синтеза при добавлении в форме tris-DOTA (Intavis, Германия).

Для сравнения использовали PSMA-617 (Huayi Isotopes, Китай), нацеленный на PSMA, в связи с отсутствием коммерческих препаратов, направленных на бомбезиновые рецепторы.

Анализ синтеза, а также контроль чистоты коммерческого PSMA-617 (Huayi Isotopes, Китай) выполняли с использованием хроматографической системы Shimadzu LC-20AD XR (Shimadzu, Япония), оснащенной спектрофотометрическим детектором SPD-20A, по принципу обращенно-фазовой хроматографии с помощью колонки Luna C18 (Dr. Maisch, Германия) и градиентного элюирования от 95 до 0% ацетонитрила («Криохром», Россия) и от 0 до 100% — деионизированной воды в течение 40 мин. Масс-спектрометрический анализ проводили на основе масс-спектрометрии MALDI-TOF на масс-спектрометре MALDI-TOF MS серии FLEX (Bruker Daltonics, Германия). Пептид очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии — системы хроматографии NGC Quest 10 (Bio-Rad, США) с использованием сорбента Bio-Gel P-4 на колонке Econo-Column 1×30 cm (Bio-Rad, США).

Мечение пептидной конструкции BBN/C1-C2 и PSMA-617 изотопом лютеция и анализ стабильности. В качестве радиолиганда использовали хлорид лютеция ¹⁷⁷Lu. BBN/C1-C2 и PSMA-617 метили при 80°С в течение 20 мин при мольном соотношении хлорида лютеция (100 МБк в 0,05 N соляной кислоте) и пептида 1:10 в ацетатном буфере с pH=4 в присутствии аскорбиновой кислоты. Активность образцов измеряли с помощью гамма-счетчика ISOMED 2010 (PTW, Германия). Мечение пептидов проводили на комплексе Gaia/Luna (Elysia-Raytest, Германия). Радиохимическую чистоту анализировали на хроматографе Shimadzu (Shimadzu, Япония) с детектором GABI (Elysia-Raytest, Германия) при градиенте ацетонитрил/вода: 0–5 мин — 2% ацетонитрила, 5–20 мин — 95% ацетонитрила, 20–25 мин — 2% ацетонитрила; вода была подкислена трифторуксусной кислотой (0,01%). Система работала под управлением программного обеспечения Clarity (Clarity Software, Великобритания). Очистку меченых пептидов от свободного лютеция выполняли с помощью одноразовых картриджей C18 (ABX, Германия), использовали комплекс GAIA по принципу гель-фильтрации. Радиохимическую стабильность оценивали при тех же параметрах через 24, 48, 96 и 168 ч в 0,9% хлориде натрия при температуре 37°С. Химическую стабильность фиксировали аналогично в 0,9% хлориде натрия, как описано выше. Хроматографическую чистоту вычисляли в процентах площади пика целевого вещества от суммарной площади пиков на хроматограмме, принятой за 100%.

Мечение пептидной конструкции BBN/C1-C2 и PSMA-617 флуоресцентным красителем. Для анализа связывания использовали флуоресцентный краситель 6-FAM в форме амина («Люмипроб», Россия). Пептиды метили по стандартному протоколу производителя: растворяли в 0,1 М растворе NaHCO₃, после чего к раствору добавляли краситель 6-FAM и инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Очистку пептидов от избытка красителя осуществляли методом спиртовой преципитации. Для очистки одну часть раствора меченого пептида смешивали с девятью частями охлажденного при температуре –20°С 95% этанола. Далее пептиды инкубировали в течение 90 мин также при температуре –20°С. После инкубации охлажденный раствор центрифугировали 15 мин при 13 000 об./мин в центрифуге Allegra (Beckman Coulter, США). После центрифугирования снимали супернатант, содержащий меченый пептид, и высушивали с использованием вакуумного концентратора (Eppendorf, Германия).

Анализ связывания меченных 6-FAM пептидов с клеточными культурами. Связывание пептидов проводили с использованием клеточных культур HCT-116, LnCap, PC-3, CHO-K1. Культуры HCT-116 (колоректальная карцинома человека) и CHO-K1 (эпителиальная клеточная линия, полученная из яичника китайского хомяка) получены из Российской коллекции клеточных культур позвоночных. Культуры LnCap (PSMA-положительная аденокарцинома предстательной железы человека) и PC-3 (PSMA-отрицательная аденокарцинома предстательной железы человека, полученная из костных метастаз) были любезно предоставлены Национальным медицинским исследовательским центром онкологии им. Н.Н. Блохина. Культуры HCT-116 и PC-3 содержались на питательной среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина в конечной концентрации 40 мкг/мл. Культура LnCap содержалась в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Biosera, Франция), пирувата натрия, витаминов для RPMI и пенициллина/стрептомицина («ПанЭко», Россия). Культура CHO-K1 содержалась в среде DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Biosera, Франция) и гентамицина в конечной концентрации 40 мкг/мл. Все культуры содержались в CO₂-инкубаторе (Sanyo, Япония) при 37°С и 5% CO₂, пассаж выполняли каждые 3–4 дня с использованием 0,25% трипсина («ПанЭко», Россия), эксперимент проводили в пределах трех первых пассажей.

За 24 ч до начала эксперимента культуры высеивали в 24-луночные планшеты в концентрации 100 000/лунку (культура LnCap — 150 000/лунку) для достижения экспоненциальной стадии. После этого к культуре добавляли FAM-меченые пептиды BBN/C1-C2 и PSMA-617 в конечной концентрации 1 мкМ и инкубировали их в течение 3 ч. По окончании инкубации среду с несвязавшимися пептидами удаляли, лунки планшета промывали охлажденным фосфатным буфером и фиксировали сигнал флуоресценции с использованием оптической системы, включающей микроскоп Nikon Ti-S, камеру DS-Qi1MC, объектив S Plan Fluor ELWD 20×0.45, фильтр 465-495/515-555 нм (Nikon, Япония) и компьютер с пакетом NIS-elements 4.0.

Количественный анализ изображений выполняли с использованием программного обеспечения ImageJ. Для каждого пептида анализировали сигнал флуорес­ценции с более 300 клеток. Интенсивность флуо­ресценции вычисляли по формуле: общая флуоресценция клеток = интегральная плотность – (площадь выделенной клетки × среднюю флуоресценцию фоновых показателей), как описывали A. Khokhlova с соавт.[22]. Кратко это выглядит так: для получения флуоресцентного сигнала каждой конкретной выделенной клетки в программе ImageJ снимается параметр интегральной плотности, затем из этого параметра вычитается флуоресценция фона, равного по площади размеру клетки. В качестве контроля фиксировали сигнал флуоресценции без добавления пептидов. Данные представляли в виде относительных единиц флуоресценции.

Анализ экспрессии генов, кодирующих целе­вые рецепторы. Тотальную РНК выделяли из суспензии клеточных линий HCT-116, LnCap, PC-3 и CHO-K1 с помощью набора «Проба-НК» («ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции по применению, кДНК синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции MMLV RT kit («Евроген», Россия) с рандомными декануклеотидными праймерами. ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили на готовой смеси для ПЦР 5X qPCRmix-HS с Taq-полимеразой («Евроген», Россия) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Выравнивание результатов для определения относительного уровня экспресии генов GRPR и FOLH-1 (PSMA) выполняли на мРНК гена домашнего хозяйства GAPDH. Реакция по гену GAPDH также служила в качестве внутреннего контроля для определения эффективности выделения РНК и прохождения реакции обратной транскрипции. Для постановки ПЦР в режиме реального времени подбирали видоспецифические праймеры и зонды на мРНК генов GRPR, FOLH-1 (PSMA), а также GAPDH человека и GAPDHCricetulus griseus (при анализе РНК, выделенной из клеточной линии CHO-K1). Праймеры подбирали с соответствии с экзон-экзонными переходами для получения специфичности по отношению к мРНК, отсутствие положительного результата на геномной ДНК проверяли путем постановки ПЦР без обратной транскрипции на образцах геномной ДНК человека, а также ДНК, выделенной из клеточной линии CHO-K1. Расчет уровня экспрессии проводили по формуле:

R=2^{[СtGAPDH–Ct(GRPR/FOLH-1)],}

где R — относительный уровень экспрессии гена GRPR/FOLH-1; CtGAPDH — средний пороговый цикл (Ct) прохождения реакции GAPDH; Ct(GRPR/FOLH-1) — средний пороговый цикл (Ct) прохождения реакции GRPR/FOLH-1.

Ни один человек/животное не принимали непосредственного участия в процессе отбора биоматериала во время этого исследования. Российские нормативные акты не требуют согласования использования биоматериалов клеточных линий для научных исследований (Федеральный закон от 23 июня 2016 г. №180-ФЗ).

Статистическая обработка данных. При анализе связывания обработка данных была проведена в программе OriginPro (OriginLab Corporation, США; v. b9.5.0.193) с использованием критерия Стьюдента, при анализе стабильности — с помощью критерия Манна–Уитни. Для определения характера распределения использовали критерий асимметрии и эксцесса. Поскольку данные при анализе связывания сравнивались с контрольной группой, а также с отрицательной группой (культура CHO-K1), для устранения эффекта множественных сравнений применяли критерий Бонферрони и различия между группами считали статистически значимыми при р≤0,02. Все данные представлены в виде M±SD, где M — среднее значение, SD — стандартное отклонение.

Результаты

Синтез и анализ пептидов. В результате твердофазного синтеза получена пептидная конструкция BBN/C1-C2 с молекулярной массой 5266,935 Да и чистотой более 80% (рис. 1).

---

Рис. 1. Масс-спектрограмма (а), хроматограмма (б) пептидной конструкции BBN/C1-C2 и хроматограмма PSMA-617 (в)

---

Поскольку молекулярная конструкция создана на основе кноттина, который формирует три дисульфидных мостика, необходимо было провести рефолдинг дисульфидных связей. В итоге молекулярная масса конструкции изменилась на 5260,163 Да. После последующей очистки чистота сложенного пептида составляла 95,1%, чистота коммерческого PSMA-617 — 99,1%.

Мечение пептидной конструкции BBN/C1-C2 и PSMA-617 изотопом лютеция и анализ стабильности. При мечении BBN/C1-C2 и PSMA-617 изотопом лютеция ¹⁷⁷Lu получены следующие результаты (рис. 2). Видно, что выход мечения BBN/C1-C2 и PSMA-617 составляет 80–90%.

---

Рис. 2. Радиохроматограммы пептидной конструкции BBN/C1-C2 (а, в) и предшественника PSMA-617 (б, г) до мечения (а, б) и после мечения (в, г)

---

При анализе стабильности меченых структур выявлено, что открепление радиоизотопа от Lu-PSMA-617 происходит уже в первые 24 ч, радиохимическая чистота снижается с (99,7±3,2) до (39,6±4,1)% (рис. 3, а).

---

Рис. 3. Радиохимическая (а) и химическая (б) стабильность BBN/C1-C2 и PSMA-617 * статистически значимое различие с BBN/C1-C2

---

Через 48 ч после окончания мечения радиохимическая чистота Lu-PSMA-617 снижается до (19,7±2,9)%, а через 168 ч она составляет (9,2±0,7)%. Химическая стабильность PSMA-617 также снижается. Так, в первые 24 ч чистота падает с (99,1±2,6) до (80,6±6,7)%, а через 168 ч она составляет (42,9±3,4)% (рис. 3, б). При этом BBN/C1-C2 на основе кноттина сохраняет не только радиохимическую стабильность, но и химическую. Так, химическая стабильность BBN/C1-C2 через 24 ч составляет (93,4±6,2)% от изначальных (95,1±5,7)%, через 48 ч — (92,6±3,9)%, а через 168 ч — (90,1±4,3)% (см. рис. 3, б). Радиохимическая чистота также снижается незначительно: через 24 ч после окончания мечения она составляет (91,3±3,8)% от (93,8±2,6)% изначальных, через 48 ч — (89,1±3,1)%, а через 168 ч — (85,2±6,2)%.

Радиохроматограммы меченых структур через 168 ч представлены на рис. 4, где можно увидеть, что через 168 ч радиоизотоп практически полностью открепился от молекулы PSMA-617, в то время как BBN/C1-C2 сохраняет результат мечния на уровне 80%.

---

Рис. 4. Радиохроматограммы Lu-BBN/C1-C2 (а) и Lu-PSMA-617 (б)

---

Анализ связывания 6-FAM-меченых пептидов с клеточными культурами. Поскольку решающим фактором для таргетных структур является не только химическая и радиохимическая стабильность, но и их способность прикрепляться к рецепторам на поверхности раковых клеток, было проанализировано связывание флуоресцентно-меченых молекул BBN/C1-C2 и PSMA-617 с соответствующими рецепторами на поверхности клеток — бомбезиновым рецептором для молекулы BBN/C1-C2 и простатспецифическим мембранным антигеном для молекулы PSMA-617 (рис. 5). Видно, что молекула PSMA-617 связывается с культурой LnCap, поскольку данные клетки в значительной степени экспрессируют PSMA (рис. 5, в). В то же время с культурами HCT-116, PC-3 и CHO-K1 данная молекула не связывается, что обусловлено отсутствием или низкой экспрессией целевых рецепторов. И наоборот, пептидная структура BBN/C1-C2 на основе тропного короткого бомбезинового пептида и кноттина в значительной степени связывается со всеми тремя опухолевыми культурами, в особенности с культурой LnCap, поскольку эти культуры значительно экспрессируют рецептор бомбезина, в то время как культура CHO-K1 экспрессирует данный рецептор в незначительном количестве, в связи с чем сигнал флуоресценции не фиксировался в пределах эксперимента.

---

Рис. 5. Результаты связывания 6-FAM-BBN/C1-C2 и 6-FAM-PSMA-617 (а) с культурами HCT-116 (б, 1), LnCap (б, 2), PC-3 (б, 3) и CHO-K1 (б, 4) в соответствии с уровнем экспрессии гена, кодирующего целевой рецептор (в) (представлено фото для 6-FAM-BBN/C1-C2) * статистически значимое различие с контролем, # статистически значимое различие с культурой CHO-K1

---

Обсуждение

Одним из ключевых аспектов терапии рака является адресная доставка терапевтических агентов к раковым клеткам, позволяющая максимизировать эффективность лечения и минимизировать вред для здоровых тканей. Биоактивные пептиды привлекли внимание благодаря своим потенциальным противораковым свойствам. Подходы на основе использования пептидов предлагают несколько преимуществ при лечении рака, включая повышенную специфичность, снижение токсичности для нормальных тканей и универсальность в воздействии на различные молекулярные пути, участвующие в прогрессировании рака [23]. Так, например, первое поколение радиолигандов бомбезина представляли агонисты GRPR, полученные из С-концевых фрагментов тетрадекапептида бомбезина амфибий. Агонисты GRPR обладают свойством интернализоваться при связывании с рецепторами, что способствует длительному удержанию препарата в клетке-мишени и считается предпосылкой для высокого поглощения in vivo [24]. Одним из первых радио­лигандов бомбезинового рецептора стал препарат (99m)Tc-N(3)S-X-BBN[7-14]NH(2) [25]. Препарат был опробован на небольшой группе пациентов с раком простаты и молочной железы и помог успешно визуализировать четыре из шести случаев рака молочной железы и одну из четырех андроген-резистентных карцином предстательной железы, метастазирующих в кости [26]. Еще одно, более современное исследование [27] показало Ga-меченый антагонист GRPR в качестве перспективного агента для визуализации рака. Работа была проведена на модели ксенотрансплантата опухолевых клеток PC-3. Исследуемый антагонист GRPR показал высокое поглощение опухолью при крайне низком поглощении здоровыми тканями, что дает высокий контраст опухоли к фоновым тканям при проведении ПЭТ-исследования.

Основным ограничением для широкого применения пептидов в качестве лекарств является их низкая стабильность in vivo вследствие чувствительности к экстремальным условиям внутренней среды организма, таким как температура и действие ферментов [28]. Одним из ключевых протеолитических ферментов является нейтральная эндопептидаза, ответственная за каталитическую инактивацию многих нейропептидных субстратов, включая бомбезин-подобные пептиды. Нейтральная эндопептидаза в изобилии экспрессируется в организме человека, включая стенки сосудов, основные органы и ткани, потенциально затрудняя визуализацию и терапию путем расщепления радиопептидов на аминокислотной стороне гидрофобных аминокислот. Высвобожденные неактивные радиометаболиты не могут взаимодействовать с рецепторами-мишенями, ассоциированными с опухолью, и в результате диагностическая чувствительность и терапевтическая эффективность серьезно снижаются [29]. Другой проблемой терапевтического применения пептидов является их быстрый почечный клиренс, связанный с чувствительностью пептидов к фильтрации почечными клубочками вследствие небольшого размера и с затрудненной реадсорбцией через почечные канальцы [30]. Увеличение физического размера молекулы будет способствовать сопротивлению почечному клиренсу и увеличению времени циркуляции молекулы в крови.

Одним из способов преодоления ограничения со стороны протеаз и увеличения стабильности пептидов к условиям среды организма является использование пептидов с цистиновым узлом. Такие пептиды представляют собой класс пептидов длиной 30–50 аминокислот. Благодаря своей своеобразной трехмерной структуре они обладают высокой устойчивостью к повышению температуры и воздействию протеаз. В нашей работе использован короткий пептид бомбезин, стабилизированный за счет включения в структуру токсина U5-scytotoxin-Sth1a из паука Scytodes thoracica. Выполнен сравнительный анализ BBN/C1-C2 с PSMA-617 в связи с отсутствием коммерческих радиофармпрепаратов, направленных на бомбезиновые рецепторы.

В настоящее время активно ведутся подобные исследования с использованием кноттинов в качестве каркаса для терапевтических пептидов. Например, A.P. Silverman и соавт. [31] использовали укороченную форму агути-родственного белка (AgRP), пептида с цистиновым узлом в качестве молекулярного каркаса для пептидов, тропных α_vβ₃-интегринам. Полученные синтетические пептиды показали более высокую специфичность к целевому рецептору, а также отсутствие неспецифического связывания, характерного для исходного терапевтического пептида. Однако такие сконструированные пептиды, как описанный выше, обладают меньшей стабильностью в отличие от пептидов на основе кноттинов, полученных из природных источников.

В 2021 г. T. Kimura [32] опубликовал работу, в которой исследовал возможность использования кноттина GTx1-15, выделенного из яда паука птицееда Grammostola rosea, в качестве каркаса для терапевтических пептидов. Кноттин показал высокую стабильность в плазме крови, низкую цитотоксичность и антигенность. Данный кноттин рассматривается автором исключительно как перспективный каркас для будущих терапевтических молекул. Однако дальнейших исследований с практическим применением кноттина GTx1-15 не проводилось.

Структура BBN/C1-C2 в сравнении с PSMA-617 сохраняет в течение длительного времени не только химическую стабильность, но и радиохимическую (см. рис. 3 и 4). Так, например, через 168 ч BBN/C1-C2 имеет химическую чистоту (90,1±4,3)%, а радиохимическую — (85,2±6,1)%. При этом PSMA-617 через такое же время сохраняет химическую чистоту (42,9±3,4)%, а радиохимическую — (9,2±0,7)%.

Отдельно было рассмотрено, влияет ли встраивание тропного пептида в структуру токсина на связывание с поверхностью клеточных культур (см. рис. 5, а). PSMA-617 показал высокую степень прикрепления к культуре LnCaP, что связано с высокой экспрессией на поверхности клеток простатспецифичного мембранного антигена, на который направлен данный препарат (см. рис. 5, в). В случае с конструкцией BBN/C1-C2 пептид связывался как с культурой HCT-116, так и с культурами LnCap и PC-3. Все культуры экспрессируют на своей поверхности бомбезиновые рецепторы [33–35]. Однако в пределах эксперимента не зафиксирован сигнал флуоресценции при анализе связывания обоих пептидов с культурой CHO-K1, что вызвано либо отсутствием экспрессии рецептора PSMA, либо слабой экспрессией рецептора GRPR. В данном случае CHO-K1 использовали в качестве контрольной культуры для подтверждения отсутствия конкурентного связывания структуры BBN/C1-C2 с другими клеточными рецепторами и ионными каналами. Молекула BBN/C1-C2 создана на основе токсина, способного крепиться к ионным каналам млекопитающих, в связи с этим существовала вероятность, что исследуемая молекула независимо от наличия встраиваемого короткого пептида сохранит возможность связываться с ионными каналами на поверхности нормальных клеток [36]. Однако наше исследование показало, что молекула BBN/C1-C2 связывается исключительно с целевыми рецепторами бомбезина, что, по всей вероятности, обусловлено модификацией ключевого домена токсина, отвечающего за связывание с каналом-мишенью.

Заключение

Созданная на основе короткого пептида бомбезина и токсина с цистиновым ингибиторным узлом (кноттина) конструкция обладает повышенной стабильностью, при этом сохраняет способность связываться с раковыми клетками. Это позволяет рассматривать стратегию создания подобных структур на основе кноттинов в качестве стабилизирующего каркаса для коротких пептидов при дальнейшей разработке пептид-рецепторной терапии.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект №123020700216 (FEUF-2023-0004)).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.