Разработка ДНК-биочипа для параллельной детекции бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии

Введение

Внебольничная пневмония (ВП) — острый инфекционный воспалительный процесс легочной ткани, возникший во внебольничных условиях (вне стационара) или диагностированный в первые 48 ч с момента госпитализации, сопровождающийся симптомами инфекции нижних отделов дыхательных путей и рентгенологическими признаками [1].

Внебольничная пневмония является одной из самых распространенных инфекционных патологий в мире. По данным Европейского респираторного общества, в странах Евросоюза общее число пациентов с ВП ежегодно превышает 3 млн человек. В США ежегодно диагностируется 5–6 млн случаев ВП, из которых более 1 млн требуют госпитализации [2]. Заболеваемость ВП в Европе и Северной Америке составляет 5–10 случаев на 1 тыс. населения [3]. По данным ВОЗ, в 2019 г. смертность от ВП составила 2,6 млн случаев, что явилось четвертой ведущей причиной смертности в мире [4].

В России ВП также вносит существенный вклад в структуру инфекционной заболеваемости. При среднемноголетнем показателе 391,82 случая на 100 тыс. населения в 2022 г. заболеваемость ВП составила 407,29 случая на 100 тыс. населения [5]. Смертность от ВП в России составляет 17–18 случаев на 100 тыс. населения и зависит от степени тяжести заболевания и индивидуальных особенностей пациентов (возраст, сопутствующие заболевания, состояние иммунной системы) [6].

К возбудителям ВП относят многие бактериальные патогены, основным из которых является Streptococcus pneumoniae, вызывающий до 30–50% случаев заболевания. Haemophilus influenzae в амбулаторной практике встречается примерно в 10% случаев как в мире, так и в России. Известно, что 8–30% случаев нетяжелой ВП обусловлены Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae [6].

Несмотря на широкое внедрение в лабораторную практику молекулярно-генетических и других современных методов, доля установления ВП данной этиологии достигает только 40–60% [7].

Своевременная идентификация возбудителя ВП важна для верного выбора тактики ведения пациентов и определения характера проводимых противоэпидемических мероприятий [8–13]. Однако симптомы ВП отличаются вариабельностью и неспецифичностью, в связи с чем разработка новых способов детекции этио­логических агентов ВП с помощью современных технологий остается актуальной задачей.

Для решения данной задачи хорошей перспективой может служить разработка ДНК-биочипов, позволяющих проводить параллельную детекцию широкого спектра возбудителей ВП. Многие из разработанных на сегодняшний день ДНК-биочипов предназначены для типирования патогенов, ассоциированных с заболеваниями органов дыхания. Так, сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН разработаны гелевые ДНК-биочипы низкой плотности для типирования штаммов Mycobacterium tuberculosis и определения генетических детерминантов лекарственной устойчивости [14]. Кроме того, в сотрудничестве с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского ими был разработан ДНК-биочип для типирования вируса гриппа А, используемого с целью эпидемиологического мониторинга циркуляции возбудителя [15]. Разработка ДНК-биочипов, предназначенных для детекции широкого спектра возбудителей заболеваний органов дыхательной системы, в России ранее не проводилась.

За рубежом в 2019 г. на основе платформы Agilent (США) был разработан ДНК-биочип для серотипирования S. pneumoniae, точность которого была сопоставима с методом ПЦР [16].

Большое распространение получили биочипы компаний Affymetrix (США) [17] и Genomica (Испания) [18], позволяющие определять широкий спектр бактериальных патогенов. Одной из последний разработок является ДНК-биочип низкой плотности, описанный в работе X. Ma с соавт. [19], который предназначен для определения 15 видов бактерий, ассоциированных с развитием ВП.

Однако широкий спектр патогенов, которые определяются биочипами, описанными выше, обусловливает высокую стоимость и сложность пробоподготовки, поскольку для выполнения анализа требуется значительное количество специфических праймеров, что затрудняет применение биочипов в лабораторной практике. Другим недостатком этих биочипов является невозможность различения носительства и патоген-обусловленной инфекции [19]. В такой ситуации актуальна разработка ДНК-биочипов, характеризующихся оптимальным соотношением стоимости исследования, производительности и точности результатов. Данная задача может быть решена с применением ДНК-биочипов высокой плотности, позволяющих использовать в процессе пробоподготовки рандомные праймеры с сохранением чувствительности и специфичности анализа. При этом качество получаемых результатов также в значительной степени будет зависеть от использования оптимальных протоколов пробоподготовки и оптимального соотношения параметров гибридизации материала [20]. В число этих параметров входят размер фрагментов и количество гибридизуемой ДНК, температура гибридизации и другие.

Целью работы явилась разработка экспериментального варианта ДНК-биочипа для параллельной детекции бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии.

Материалы и методы

Разработка дизайна ДНК-биочипа и его синтез. Алгоритм селекции ДНК-зондов для специфичной детекции возбудителей ВП был предложен нами ранее и реализован в виде программы для ЭВМ disprose (DIScrimination PRObe SElection), написанной на языке программирования R [21]. С применением данного алгоритма разработан дизайн ДНК-биочипа, предназначенного для идентификации основных бактериальных возбудителей ВП, циркулирующих в мире: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila. Сборку целевой и неспецифической баз нуклеотидных последовательностей, использованных при отборе ДНК-зондов с помощью такого алгоритма,формировали из базы данныхNCBI Nucleotide [22]. Схему распределения зондов на поверхности слайда составили с использованием приложения Layout Designer (CustomArray, США). Синтез зондов проводили на слайды CustomArray Blank Slide 12K (CustomArray, США). На слайды были синтезированы целевые зонды, зонды отрицательного контро­ля (negative control, NC — специфичные к геному бактерии Rhizobium rubi, подобранные с применением указанного алгоритма) и зонды контроля качества синтеза (quality control, QC), не специфичные к последовательностям исследуемых патогенов, которые были установлены производителем платформы (CustomArray, США). Синтез зондов осуществляли с помощью модифицированного амидофосфитного метода на аппарате B3 Synthesizer (CustomArray, США) в соответствии с протоколом производителя [23, 24] и с использованием комплекта реагентов (Sigma-Aldrich, США, Германия, Франция; Panreac, Испания; Merck Sharp & Dohme, США; «Биохим», Россия).

Материалы исследования. Материалом для исследования служили образцы мазков слизистой оболочки глотки детей 1–15 лет с рентгенологически подтвержденным диагнозом «пневмония», находившихся на стационарном лечении в медицинских организациях Нижнего Новгорода.

От всех лиц, представляющих несовершеннолетних пациентов, врачами медицинских организаций получено добровольное информированное согласие в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013).

Отбор образцов для исследования. Наличие ДНК возбудителей ВП подтверждали методом ПЦР с помощью набора GenPak DNA PCR test (ООО «Галарт-Диагностикум», Россия) для детекции S. pneumoniae, H. influenzae и L. рneumophila и набора «АмплиСенс Mycoplasma pneumoniae/Chlamydophila pneumoniae-FL» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) для детекции ДНК M. pneumoniae и C. рneumoniae. С целью подбора параметров гибридизации ДНК на биочип и оценки воспроизводимости результатов пулировали 18 образцов, содержащих ДНК S. pneumoniae (18/18, 100% образцов) и/или H. influenzae (9/18, 50% образцов). Для тестирования выявляемости S. pneumoniae и H. influenzae в клинических образцах использовали по три клинических образца, содержащих исключительно S. pneumoniae или H. influenzae. В качестве отрицательного образца использовали пул из шести образцов мазков слизистой оболочки глотки здоровых доноров, не содержащих ДНК бактериальных возбудителей ВП.

Пробоподготовка ДНК и ее гибридизация на биочип. Выделение ДНК из образцов проводили с помощью набора реактивов «РИБО-преп» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Выполняли дополнительную очистку ДНК с помощью 3 M ацетата натрия (рН=7,0) и изопропанола («Биохим», Россия). ДНК в количестве 2–3 мкг фрагментировали набором реактивов NEBNext dsDNA Fragmentase (New England Biolabs, Великобритания). Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Eppendorf Bio Photometer Plus (Германия). Фрагментированную ДНК концентрировали изопропанолом в присутствии 3 M ацетата натрия (рН=7,0). Амплификацию ДНК в количестве 1,2 мкг проводили с помощью набора реактивов Encyclo Plus PCR kit («Евроген», Россия) и рандомных декануклеотидных праймеров Random (dN)10-primer («Евроген», Россия) с использованием амплификатора MaxyGene Gradient (Axygen, США), Температурный профиль реакции: денатурация при 95°С — 1 мин, 30 циклов (95°С — 15 с, 30°С — 1 мин, 72°С — 45 с), финальная элонгация — 8 мин. Полученную ДНК концентрировали охлажденным изопропанолом в присутствии 3 M ацетата натрия (рН=7,0). ДНК в количестве до 4 мкг использовали в качестве матрицы для in vitro репликации набором реагентов «ДНК-полимераза I E. coli (фрагмент Кленова)» (SibEnzyme, Россия) и рандомных декануклеотидных праймеров Random (dN)10-primer («Евроген», Россия). В состав синтезируемой ДНК вводили биотиновую метку путем замены половины количества дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) на его биотинилированный аналог Bio-12-dUTP («ДНК-синтез», Россия). Полученную биотинмеченую ДНК концентрировали охлажденным изопропанолом в присутствии 3 M ацетата натрия (рН=7,0). Итоговое количество биотинмеченой ДНК варьировало в пределах 2,0–3,5 мкг, что достаточно для гибридизации на биочип. Гибридизацию таргетных биотинмеченых ДНК на биочип и их последующую отмывку (для повторного использования биочипа) проводили согласно инструкции производителя (CustomArray, США). Определяли оптимальное сочетание трех параметров гибридизации: размера фрагмента целевой ДНК (200, 300, 400 н.о.), количества гибридизуемой ДНК (1, 2 и 3 мкг) и температуры гибридизации (40, 42, 45, 47 и 50°С).

Математическая обработка и анализ сигналов гибридизации. Сигналы гибридизации в виде файлов в формате ECD экспортировали в формат CSV с помощью программы Electra Sense Analysis v. 3.4.2 (CustomArray, США). Расчеты проводили в свободно распространяемой среде программирования R v. 3.6.1 [25].

Первичные сигналы гибридизации подвергали процедуре стандартизации и получали стандартизированный сигнал гибридизации (ССГ), выраженный в Z-единицах по формуле

Z=(X–M_NC)/SD_NC,

где Х — первичный сигнал гибридизации анализируемого зонда, M_NC — среднее арифметическое значение сигналов зондов отрицательного контроля, SD_NC — стандартное отклонение сигналов зондов отрицательного контроля.

Зонды с ССГ более 10 Z оценивали как зонды с неспецифическим/частичным связыванием и исключали из дальнейшего анализа. Уровень сигнала выше 3 Z оценивали как эффективный [26], выше 4 Z — высокий, выше 5 Z — очень высокий.

Для каждой комбинации параметров гибридизации определяли показатели качества гибридизации: эффективность, специфичность — соотношение уровней специфичных и неспецифичных сигналов — и соотношение параметров чувствительности и специфичности. Тестировали каждую из комбинаций параметров, последовательно отбирая наилучшие варианты.

Эффективность гибридизации оценивали как процент эффективных зондов от всей совокупности тестовых зондов. Для оценки влияния параметров гибридизации на соотношение уровней специфических и неспецифических сигналов рассчитывали отношение медиан ССГ эффективных специфических и неспецифических зондов. В качестве специфических зондов использовали зонды, предназначенные для идентификации S. pneumoniae и H. influenzae, в качестве неспецифических — зонды для идентификации M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila. Соотношение чувствительности и специфичности определяли с помощью ROC-анализа.

ROC-анализ. При выполнении ROC-анализа рассчитывали чувствительность и специфичность биочипа при наборе порогов значимого сигнала (ПЗС). Под ПЗС понимали такой уровень ССГ зонда, превышение которого позволяло трактовать результат гибридизации как свидетельство присутствия в образце ДНК возбудителя. При расчетах учитывали только эффективные зонды. Чувствительность и специфичность рассчитывали для каждого из тестируемых ПЗС по следующим формулам:

чувствительность = ИП / (ИП + ЛО);

специфичность = ИО / (ИО + ЛП),

где ИП — количество истинно-положительных зондов (зондов, предназначенных для детекции S. pneumoniae и H. influenzae, стандартизированный сигнал которых выше тестируемого порогового значения); ЛП — количество ложноположительных зондов (зондов, предназначенных для детекции M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. pneumophila, стандартизированный сигнал которых выше тестируемого порогового значения); ИО — количество истинно-отрицательных зондов (зондов, предназначенных для детекции M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. pneumophila,стандартизированный сигнал которых ниже или равен тестируемому пороговому значению); ЛО — количество ложноотрицательных зондов (зондов, предназначенных для детекции S. pneumoniae и H. influenzae, стандартизированный сигнал которых ниже или равен тестируемому пороговому значению).

На основании полученных значений строили ROC-кривую, рассчитывали площадь под кривой AUC (area under curve) и определяли ПЗС, соответствующий максимальному значению индекса Юдена (оптимальному соотношению чувствительности и специфичности), и ПЗС, соответствующий максимальной специфичности теста.

Оценка воспроизводимости результатов. Гибридизацию пулированного образца ДНК выполняли на трех разных слайдах после однократной гибридизации и последующей отмывки, а также три раза на одном слайде с последующими отмывками. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена ρ между электрохимическими сигналами гибридизации слайдов, а также рассчитывали коэффициент вариации (Cv) каждого зонда на разных слайдах по формуле

Cv=(SD/M)·100%,

где SD — стандартное отклонение ССГ зонда, M — среднее арифметическое значение ССГ зонда на всех протестированных слайдах.

Отбор эффективных зондов для детекции S. pneumoniae и H. influenzae. Последовательности специфических зондов, предназначенных для детекции S. pneumoniae и H. influenzae и продемонстрировавших эффективную гибридизацию при подобранных параметрах гибридизации пулированного образца, выравнивали относительно референсной последовательности генома соответствующего патогена. В качестве референса для S. pneumoniae использовали последовательность «Streptococcus pneumoniae R6, complete sequence» (номер в базе данных NCBI Nucleotide — NC_003098), для H. influenzae — последовательность «Haemophilus influenzae strain Hi375 chromosome, complete genome» (номер в базе данных NCBI Nucleotide — NZ_CP009610).

Локальное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с применением программы BLASTN пакета программ BLAST+ v. 2.10.0 [27]. Определяли участки референсного генома, на которые отобранные зонды выравнивали с идентичностью 100% при отсутствии точечных несовпадений и пропусков нуклеотидов. Для аннотации выявленных участков референсных геномов использовали данные базы NCBI Nucleotide [22]. Затем с целью расширения панели используемых зондов выбирали все зонды (составляющие дизайн биочипа и специфичные к выявленным участкам), которые были предназначены для детекции S. pneumoniae или H. influenzae.

Тестирование биочипа. Для разработанногоДНК-биочипапроводили тестирование возможности выявления возбудителей ВП S. pneumoniae и H. influenzae в клинических образцах.В качестве специфического сигнала рассматривали эффективный сигнал пула специфических зондов, выбранных на предыдущем этапе. Далее с помощью ROC-анализа определяли ПЗС, соответствующий максимальной специфичности теста. Для S. pneumoniae и H. influenzaе ПЗС определяли отдельно.

Статистическая обработка данных. Анализ данных проводили в свободно распространяемой среде программирования R v. 3.6.1. Использовали методы статистики с определением среднеарифметической величины (M), стандартного отклонения (SD), медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1 и Q3), коэффициента корреляции Спирмена ρ, коэффициента вариации (Cv), с построением ROC-кривой, определением показателей AUC и индекса Юдена.

Результаты

Выбор последовательностей зондов для детекции ДНК возбудителей внебольничной пневмонии. С помощью программы disprose выбраны зонды для специфической детекции пяти бактериальных возбудителей ВП: S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila. Пул кандидатных зондов формировали путем разделения последовательностей референсных геномов на участки установленной длины. Проводили отбор кандидатных зондов по физико-химическим параметрам: длина зонда (24–32 н.о.), процентное содержание нуклеотидов гуанина и цитозина (40–60%), количество гомоповторов (менее пяти одинаковых нуклеотидов подряд), минимальная энергия фолдинга (≥0 ккал/моль), температура плавления (55–60°С). Для тестирования способности кандидатных зондов гибридизоваться с целевыми последовательностями выравнивали их алгоритмом BLAST с целевой и неспецифической базами последовательностей. Затем с помощью программы disprose отбирали максимально специфичные зонды по следующим параметрам: идентичность целевым последовательностям (покрытие — 100%, отсутствие точечных несовпадений и пробелов) и отсутствие перекрестной гибридизации с нецелевыми последовательностями (покрытие — менее 50%). В результате было отобрано по 30 зондов для детекции S. pneumoniae, M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila и 22 зонда — для детекции H. influenzae (см. приложение). Отобранные зонды были успешно синтезированы на слайды Blank Slide 12K (CustomArray, США). Каждый слайд состоял из 4 идентичных секторов, на каждом из которых содержалось 142 целевых зонда, 90 зондов отрицательного контроля и 90 зондов контроля качества синтеза.

Влияние параметров гибридизации на показатели ее качества. Нами проведен последовательный отбор наилучших сочетаний параметров гибридизации: размер фрагмента ДНК (200, 300, 400 н.о.), количество ДНК (1, 2 и 3 мкг) и температура гибридизации (40, 42, 45, 47 и 50°С) — для пулированного образца, содержащего ДНК S. pneumoniae и H. influenzaе. На всех протестированных параметрах при гибридизации отрицательного образца не детектировано сигналов эффективных зондов.

Наибольшая эффективность гибридизации выявлена в диапазоне температур 42–47°С. Эффективность гибридизации снижалась при уменьшении количества ДНК с 2 до 1 мкг, а также при повышении их количества до 3 мкг. Не установлено зависимости эффективности гибридизации от длины фрагментов ДНК (рис. 1).

---

Рис. 1. Зависимость эффективности гибридизации зондов от ее параметров 200, 300, 400 н.о. — длина гибридизируемых фрагментов ДНК; 1, 2, 3 мкг — количество гибридизируемой ДНК; рамками отмечены параметры, отобранные для дальнейшей оптимизации

---

Анализ специфичности гибридизации показал, что наибольшее количество эффективных специфических зондов (для детекции S. pneumoniae и H. influenzae) и наивысший сигнал специфической гибридизации наблюдались при следующих комбинациях параметров: 1) 1 и 2 мкг ДНК, 200 и 400 н.о., 42°С; 2) 1 и 2 мкг ДНК, 300 н.о., 47°С. Однако при этом также выявлялись сигналы эффективных неспецифических зондов (для M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. pneumophila) (рис. 2).

---

Рис. 2. Величины стандартизированного сигнала гибридизации эффективных специфических и неспецифических зондов при различных параметрах гибридизации 42, 47°С — температура гибридизации; 200, 300, 400 н.о. — длина гибридизируемых фрагментов ДНК; 1–2 мг — количество гибридизируемой ДНК. Пунктирными линиями обозначены границы сигнала высокого уровня 4 Z и очень высокого уровня — 5 Z. Рамками отмечены параметры, отобранные для дальнейшей оптимизации

---

В результате отбора выявлены две комбинации параметров гибридизации, при которых обеспечивалось максимальное количество эффективных специфических зондов. Медианы их уровней превышали медианы уровней эффективных сигналов неспецифических зондов:

1 мкг ДНК, 200 н.о., 42°С — 9 специфических зондов с ССГ=4,5 [3,6; 4,7] Z и 9 неспецифических зондов с ССГ=3,6 [3,5; 3,9] Z, превышение в 1,3 раза;

2 мкг ДНК, 300 н.о., 47°С — 13 специфических зондов с ССГ=4,3 [4,0; 5,1] Z и 8 неспецифических зондов с ССГ=3,2 [3,1; 3,6] Z, превышение в 1,3 раза (см. рис. 2).

Результаты проведенного ROC-анализа показали, что для первого варианта комбинации параметров гибридизации (1 мкг ДНК, 200 н.о., 42°С) значение AUC ROC-кривой составило 0,57, а для второго варианта (2 мкг ДНК, 300 н.о., 47°С) — 0,89. В качестве оптимальных параметров гибридизации был выбран второй вариант, для которого точка максимального значения индекса Юдена соответствовала ПЗС=3,5 Z (специфичность — 0,75; чувствительность — 0,85), а максимальной специфичности соответствовала точка ПЗС=4,5 Z (специфичность — 1,00; чувствительность — 0,46).

Таким образом, оптимальными параметрами гибридизации являются 2 мкг ДНК, 300 н.о., 47°С.

Оценка воспроизводимости. При гибридизации в выбранных условиях биочипы характеризовались высокой воспроизводимостью сигналов, полученных на разных слайдах и последовательно на одном слайде. Коэффициент корреляции ρ составил 0,93 [0,92; 0,94], а коэффициент вариации Cv — 9,3 [7,2; 11,3]%.

Характеристика зондов, специфично детектирующих S. pneumoniae и H. influenzae. На основании данных о гибридизации пулированного образца при оптимальных параметрах гибридизации из представленных в дизайне биочипа для дальнейшего применения были отобраны наиболее эффективные зонды для детекции S. pneumoniae и H. influenzae (табл. 1). Для детекции S. pneumoniae отобрали 6 из 30 присутствовавших на чипе специфических зондов, 5 из 6 зондов были специфичны к областям генома S. pneumoniae, кодирующим или комплементарным кодирующим белки, и 1 зонд был специфичен к неаннотированному участку генома. Для детекции H. influenzae отобрали все 22 из 22 присутствовавших на чипе специфических зондов. Из них 14 были комплементарны к неаннотированной области генома H. influenzae и 8 — к двум участкам, кодирующим белки.

---

Таблица 1. Характеристика зондов, специфично детектирующих S. pneumoniae и H. influenzae

---

Определение S. pneumoniae и H. influenzae в клинических образцах. При гибридизации генетического материала клинических образцов пациентов с ВП и установленным возбудителем S. pneumoniae среди эффективных зондов присутствовали специфичные ко всем пяти исследуемым патогенам (S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. рneumophila), но при этом зонды, специфичные к ДНК S. pneumoniae, демонстрировали более высокий уровень ССГ (табл. 2).

---

Таблица 2. Основные характеристики гибридизации клинических образцов, содержащих S. pneumoniae и H. influenzae

---

В связи с тем, что как специфические, так и некоторые неспецифические зонды характеризовались эффективным сигналом гибридизации, в качестве ПЗС была выбрана точка максимальной специфичности, которой достигал только сигнал специфических зондов. Такой ПЗС обеспечивал 100% специфичность, хотя и приводил к возникновению ложноотрицательных сигналов (сигналы эффективных специфических зондов, расцененные как отрицательные). Для S. pneumoniae ПЗС специфических зондов составил 4,5 Z. Аналогично при гибридизации клинических образцов пациентов с ВП и установленным возбудителем H. influenzae среди эффективных зондов присутствовали специфические и неспецифические зонды. При этом зонды, специфичные к ДНК H. influenzae, характеризовались более высоким уровнем ССГ. Выбранный ПЗС для зондов, предназначенных для детекции H. influenzae, составил 4,9 Z (см. табл. 2).

Обсуждение

С целью разработки ДНК-биочипа для параллельной детекции бактериальных возбудителей ВП с помощью собственной программы disprose и базы данных NCBI нами были подобраны последовательности ДНК-зондов, детектирующие S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. рneumoniae и L. pneumophila, которые были успешносинтезированы на биочип. Кроме индивидуальных физико-химических особенностей зондов, которые определялись при разработке дизайна биочипа, важными параметрами, влияющими на эффективность и специфичность связывания зондов с таргетной ДНК, являются температура гибридизации и количество гибридизуемой ДНК. Повышение температуры гибридизации и снижение количества гибридизуемой ДНК приводят к увеличению специфичности связывания, однако это влечет за собой снижение эффективности, и наоборот [20].

С использованием пулированных образцов ДНК S. pneumoniae и H. influenzae по разработанному нами алгоритму последовательно исследовали различное сочетание параметров гибридизации ДНК на биочип: размера фрагментов ДНК, количества ДНК и температуры гибридизации. Путем последовательного отбора было выбрано оптимальное сочетание параметров гибридизации, при котором выявляется максимальное количество эффективных и специфических сигналов зондов для детекции S. pneumoniae и H. influenzae, а именно 2 мкг ДНК, 300 н.о., 47°С.

При данном сочетании параметров гибридизации характеристики воспроизводимости сигналов, полученные как на разных биочипах, так и последовательно на одном биочипе, соответствовали показателям качества, указанным в литературе, — коэффициент корреляции выше 0,90 и коэффициент вариации менее 15% [28]. Тестирование пулированного отрицательного образца показало отсутствие эффективных сигналов зондов.

Результаты нашего исследования демонстрируют невозможность выбора одного «оптимального» зонда и необходимость оценки сигнала гибридизации пула специфических зондов для детекции каждого патогена. Нами проведен отбор синтезированных на биочипе зондов для детекции S. pneumoniae и H. influenzae, характеризующихся эффективным сигналом гибридизации в оптимальных условиях и специфичностью к выбранным участкам референсных геномов. Из них выбрано 6 зондов для детекции S. pneumoniae и22 — для H. influenzae (см. табл. 1). Отметим, что значительное количество зондов для детекции H. influenzae было специфично к ограниченным участкам генома. Это объясняется тем, что исходный отбор зондов для детекции H. influenzae был осложнен высокой степенью генетического сходства данного патогена с близкородственными возбудителями H. рarainfluenzae и H. haemolyticus, которые могут присутствовать в составе нормофлоры [29, 30]. Для снижения риска перекрестной гибридизации зондов и получения ложноположительных результатов из первоначального пула кандидатных зондов были исключены последовательности, схожие с геномом H. рarainfluenzae и H. haemolyticus. Оставшиеся зонды были комплементарны нескольким уникальным областям генома H. influenzae. Зонды для детекции S. pneumoniae выбирали из последовательностей, специфичных к участкам, располагающимся на всей протяженности генома патогена.

При тестировании клинических образцов установлено, что как специфические, так и некоторые неспецифические зонды характеризуются эффективным сигналом гибридизации, но при этом уровни ССГ специфических зондов были значительно выше. Выявление эффективных неспецифических сигналов зондов в ходе анализа клинических образцов с помощью разработанного биочипа может свидетельствовать о возможном носительстве детектируемых возбудителей. По данным литературы [31], бактериальные возбудители ВП могут входить в состав нормофлоры. Так, у здоровых детей 0–6 лет выявлены ДНК S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae и Moraxella catarrhalis, при этом частота их выявления сопоставима с частотой обнаружения у пациентов с острыми инфекциями верхних дыхательных путей. Количество случаев носительства M. pneumoniae у здоровых детей варьировало в разное время года от 3 до 58% [32], а частота асимптомного инфицирования Chlamydophila pneumoniae у детей и взрослых — в пределах 1–6% [33, 34]. Носительство Legionella species остается недоказанным [35].

Для надежной детекции ДНК возбудителей ВП с помощью биочипа при возможном носительстве, а также при возможной неспецифической гибридизации зондов биочипа представляется критически важным тщательный расчет пороговых значений значимого сигнала гибридизации зондов для детекции каждого патогена в клинически значимой концентрации. В работе [36] показано, что не существует прямой зависимости между уровнями сигналов гибридизации разных зондов и концентрацией детектируемых молекул в исследуемом образце и даже зонды, специфичные к одному участку целевой последовательности, отличаются аффинностью, а следовательно, и уровнем сигнала гибридизации. Исходя из этого, необходим расчет ПЗС для каждого из тестируемых возбудителей ВП. В качестве ПЗС нами выбраны точки максимальной специфичности (4,5 Z — для S. pneumoniae, 4,9 Z — для H. influenzae), что позволило привести интерпретацию результатов гибридизации биочипа в соответствие с результатами, полученными методом ПЦР.

Таким образом, разработанный нами ДНК-биочип при оптимальных параметрах гибридизации и значимых пороговых значениях сигналов зондов обеспечивает параллельную детекцию ДНК возбудителей ВП S. pneumoniae и H. influenzae с достаточной эффективностью, специфичностью и воспроизводимостью. Биочип не имеет аналогов в России и обладает рядом преимуществ по сравнению с зарубежными разработками. Детекция каждого патогена обеспечивается набором уникальных специфических зондов, что увеличивает вероятность обнаружения патогена в образце. За счет применения рандомных декануклеотидных праймеров обеспечены унификация пробоподготовки биоматериала, снижение себестоимости анализа и уменьшение трудозатрат. Еще одним важным преимуществом предложенного биочипа является возможность его многоразового использования (не менее пяти раз без потери качества получаемых результатов). Предложенный нами алгоритм анализа результатов гибридизации с использованием пороговых значений сигналов позволяет дифференцировать клинически значимую инфекцию и носительство бактериальных возбудителей ВП. Данный алгоритм с использованием нашего ДНК-биочипа может применяться для разработки способов детекции других бактериальных возбудителей ВП, таких как M. pneumoniae, C. рneumoniae и L. pneumophila.

Заключение

Разработан и синтезирован экспериментальный вариант ДНК-биочипа для параллельной индикации бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии: S. pneumoniae, H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae и L. pneumophila. В ходе настоящего исследования на примере бактериальных возбудителей S. pneumoniae и H. influenzae подобраны оптимальные условия гибридизации ДНК (количество — 2 мкг, размер фрагмента — 300 н.о., температура гибридизации — 47°С), позволяющие получать сигналы с достаточной чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью. Выявлен пул зондов для специфической детекции S. pneumoniae (6 штук) и H. influenzae (22 штук), характеризующихся эффективным сигналом гибридизации в выявленных условиях. Определены пороговые значения значимых сигналов зондов для специфической детекции S. pneumoniae и H. influenzae в клинических образцах, позволяющие интерпретировать результаты гибридизации (4,5 Z — для выявления S. pneumoniae и 4,9 Z — для выявления H. influenzae).

Разработанный биочип может использоваться для совершенствования лабораторной диагностики и мониторинга бактериальных возбудителей внебольничной пневмонии.

Источники финансирования. Данное исследование профинансировано из средств государственного бюджета в рамках выполнения отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на период 2021–2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.