Технология комбинированного выявления макрофагов и коллагеновых волокон в препаратах печени

Введение

Клетки Купфера — резидентные макрофаги печени, которые находятся в тесном контакте с синусоидными капиллярами печени и играют важную роль в мононуклеарной фагоцитарной системе организма. Функции данных клеток многообразны: фагоцитоз клеточного дебриса и токсинов, поступающих в печень по воротной вене; участие в метаболизме липидов (включая холестерин) и белков; обеспечение иммунного надзора; поддержание и регуляция иммунной толерантности организма [1]. Кроме того, одной из важных функций клеток Купфера является их взаимодействие с фибробластами и миофибробластами — клетками, ответственными за синтез и секрецию предшественников коллагена.

Недавние исследования показали, что провоспалительная активация макрофагов в различных тканях и органах индуцирует высвобождение интерлейкинов IL-4 и IL-13, а также профибротических факторов (TGF-β1, FGF-2, PDGF), стимулирующих эпителиально-мезенхимальную трансформацию и отложение продукции внеклеточного матрикса. Данный процесс приводит к ремоделированию внеклеточного матрикса соединительной ткани и патологическому ангиогенезу, которые в свою очередь форсируют стойкую гиперактивацию фибробластов и миофибробластов [2]. Таким образом, одной из функций макрофагов в органах и тканях (в частности, клеток Купфера в печени) является профиброгенная регуляция.

Для гистологической практики большое значение имеет разработка новых универсальных подходов, которые объединяют в себе преимущества классических гистологических методов окрасок и иммуногистохимических реакций. Одновременное исследование функционального состояния клеток Купфера и соединительной ткани обеспечивает возможность изучения развития механизмов патологических изменений в печени. Наиболее часто применяемыми способами для изучения соединительной ткани на препаратах являются гистологические методы окраски по Ван-Гизону и трихромные методы окрашивания по Маллори и Массону с анилиновым синим [3–7]. Все эти методы могут применяться для окрашивания тканей печени как в норме, так и при патологии. Однако при использовании классических гистологических методов окраски клетки Купфера не выявляются. Ранее нами было показано [8], что для обнаружения клеток Купфера удобно использовать иммуногистохимическую реакцию на микроглиальный белок Iba-1. Следовательно, для единовременного определения соединительной ткани и клеток Купфера целесообразно применить сочетание гистологической окраски коллагеновых волокон анилиновым синим и иммуногистохимического выявления данных клеток с использованием реакции на белок Iba-1. Стоит отметить, что возможность изменений свойств тканей вследствие абсорбции красителя при последовательной обработке материала для двух вариантов исследования делает результат подобного подхода неочевидным.

В связи с этим целью настоящего исследования стала оценка возможности комбинированного подхода для одновременного выявления клеток Купфера и волокнистого компонента соединительной ткани на препаратах печени.

Материалы и методы

Исследование проводили на образцах печени половозрелых (4–6 мес) крыс линий Wistar (n=3) и SHR (n=3). Крысы были получены из питомников лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область, Россия) и «Пущино» (Московская область, Россия), содержались в виварии при комнатной температуре, в стандартных условиях, со свободным доступом к пище и воде. При содержании и умерщ­вле­нии животных соблюдали этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006), и Приказ №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» (Россия, 2016). При проведении исследования были соблюдены все применимые международные принципы использования животных. Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).

Для исследования использовали левую долю печени. Образцы печени фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [9] в течение 18–24 ч при комнатной температуре. Фиксированный материал заливали в парафин по стандартной методике и изготавливали по одному блоку с каждой исследуемой доли печени. С парафиновых блоков на ротационном микротоме Microm HM 325 (Thermo Fisher Scientific, США) выполняли срезы толщиной 5 мкм, которые далее монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием (HistoBond®+M adhesive microscope slides, Marienfeld, Германия). Затем проводили стандартные процедуры депарафинирования и регидратации.

Для выявления резидентных макрофагов печени применяли моноклональные кроличьи антитела к Iba-1 (клон JM36-62; ET1705-78; HuaBio, Китай). В качестве вторичного реагента для первичных кроличьих антител использовали набор UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Fisher Scientific, США). Срезы окрашивали раствором 2% водного анилинового синего (Unisource Chemicals Pvt. Ltd., Индия), являющегося компонентом трихромной окраски Маллори и Массона, подкисленного ледяной уксусной кислотой. Для окрашивания срезов сначала наносили протраву (фосфорномолибденовую кислоту), затем — свежеприготовленный раствор анилинового синего.

После дегидратации в изопропаноле и просветления в ортоксилоле полученные препараты заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США) и анализировали с помощью светового микроскопа Zeiss Axio Scope.A1 (Carl Zeiss, Германия). Фотографирование гистологических препаратов проводили с использованием фотокамеры Zeiss Axiocam 105 color (объективы A-Plan 20×/0.45; 40×/0.65) и программы ZEN 3 (Carl Zeiss, Германия).

Морфометрический анализ полученных изображений выполняли с помощью программы ImageJ2 в расширении FIJI [10]. Для количественной оценки междольковой соединительной ткани и плотности распределения Iba-1-положительных элементов изображения были предварительно сегментированы на основе 4 цветов (красный, желтый, синий, белый) с использованием плагина IJ-Plugins Toolkit [11] и алгоритма k-средних (k-means). В результате сегментации получены бинаризированные изображения, соответствующие исследуемым структурам. Общую площадь Iba-1-иммуноокрашенных структур и коллагеновых волокон оценивали с помощью стандартных функций ImageJ2, таких как «цветовая гистограмма», «анализ частиц» и «измерение» (color histogram, analyze particles, measure). Использована также морфометрическая сетка с заданной плотностью точек (11×11), которую наносили на изображения отдельно с помощью графического редактора GIMP [12].

Для количественной оценки плотности распределения Iba-1-положительных элементов, ассоциированных с междольковой соединительной тканью, на изображениях предварительно выделяли области интереса с помощью стандартной функции ImageJ2 — «область интереса» (region of interest). После этого с помощью плагина IJ-Plugins k-means Clustering [13] выполняли сегментацию изображений на 3 цвета (RGB). Общую площадь Iba-1-иммуноокрашенных структур оценивали с помощью вышеупомянутых функций ImageJ2 для морфометрического анализа. Измеренную площадь объектов на изображении выражали в микрометрах в квадрате и в процентах.

Результаты

В ходе предварительного исследования оценена возможность окрашивания коллагеновых волокон анилиновым синим после постановки иммуногистохимической реакции на белок Iba-1 с учетом разработанного ранее протокола [8], предполагающего тепловое демаскирование антигена. Результаты проверки показали, что после выполнения этапа теплового демаскирования коллагеновые волокна выявляются неселективно, в связи с чем была проведена модификация протокола. На основании проверки различных режимов инкубации первичных реагентов был исключен этап теплового демаскирования, сокращен период инкубации первичных реагентов (с 3 до 1 дня) и увеличена температура инкубации (с 27,5 до 35°C). Этот вариант протокола позволил получить оптимальные результаты иммуногистохимической реакции.

В результате реакции на белок Iba-1 во всех исследованных образцах печени выявлено множество Iba-1-иммунопозитивных структур, морфологически соответствующих клеткам Купфера (рис. 1, а, б). Фонового окрашивания не наблюдалось. Выявленные клетки были морфологически сходны, отмечено четкое и преимущественно равномерное окрашивание цитоплазмы. В некоторых случаях в цитоплазме просматривалось место локализации ядра. Для большинства клеток Купфера было характерно наличие отростков, хорошо визуализирующихся благодаря интенсивной окраске. Во всех исследуемых образцах отростки контактировали с эндотелиальными клетками сосудов, гепатоцитами, а также другими соединительнотканными клетками в области внутренней перипортальной пограничной пластинки. Исключение этапа теплового демаскирования не оказало негативного влияния на выявляемость макрофагов, позволило снизить вероятность неспецифического окрашивания и повысить сохранность образцов ткани печени в процессе обработки срезов. В то же время повышение температуры инкубации позволило сократить пребывание срезов в растворе первичных антител. Визуально иммуногистохимическая реакция на белок Iba-1 во всех исследуемых образцах была высокоинтенсивной и не препятствовала селективному окрашиванию коллагена анилиновым синим.

---

Рис. 1. Результат окрашивания соединительной ткани анилиновым синим с выявлением клеток Купфера при помощи иммуногистохимической реакции на белок Iba-1 и количественный анализ окраски коллагеновых волокон с использованием морфометрической сетки: а, б — Iba-1-иммунопозитивные клетки и коллагеновые волокна с подкраской анилиновым синим в препаратах печени крысы Wistar; в — бинарное преобразование изображения б с применением цветовой сегментации для дифференцировки коллагеновых волокон и с демонстрацией использования точечного варианта морфометрической сетки. Стрелками показаны Iba-1-иммунопозитивные клетки, звездочками — коллагеновые волокна. Объективы A-plan 20×/0,45 (а); A-plan 40×/0,65 (б, в)

---

Окрашивание анилиновым синим во всех образцах печени крыс Wistar и SHR было избирательным, равномерным и четким и позволило дифференцировать соединительную ткань во всех срезах. Обработка срезов фосфорномолибденовой кислотой и окраска анилиновым синим после иммуногистохимической реакции на Iba-1 не оказала негативного влияния на сохранность продукта реакции хромогена DAB. Не отмечено снижения интенсивности окраски продукта иммуногистохимической реакции или вымывания его из срезов.

Использованный комбинированный метод окрашивания в дальнейшем позволил оценить морфометрическими методами площадь иммунопозитивных структур и площадь, занимаемую волокнами коллагена, в поле зрения (рис. 1, в).

В качестве примера для количественного анализа использовано изображение, представленное на рис. 1, б. Так, было проведено вычисление площади, занимаемой волокнами коллагена, с использованием морфометрической сетки. Рассчитанная площадь составила 11 617,24 мкм² (20,66% от общей площади изображения). Общая площадь Iba-1-иммуноокрашенных структур рассчитывалась на основе бинаризированного изображения с использованием гистограммы цветов и составила 2330,08 мкм² (4,15% от общей площади изображения).

С применением плагина для ImageJ2 k-means Clustering проведена автоматическая сегрегация макрофагов, ассоциированных с междольковой соединительной тканью (рис. 2). Данный плагин позволил нам избирательно оценить общую площадь макрофагов междольковой соединительной ткани и клеток Купфера, а также определить число клеток и фрагментов клеток на основе цветного изображения. Общая площадь макрофагов междольковой соединительной ткани составила 1013,61 мкм² (1,80%), а количество выявленных фрагментов клеток — 76. Общая площадь клеток Купфера составила 1316,47 мкм² (2,34%), общее количество клеток и их фрагментов — 16.

---

Рис. 2. Результат сегментации изображения на основе разделения цветовых значений по кластерам с использованием плагина k-means Clustering для ImageJ2 зеленым цветом окрашены клетки Купфера; коричневым цветом — макрофаги, ассоциированные с во­локнами междольковой соединительной ткани; звездочкой показана центральная вена

---

Обсуждение

Фиброз и активация клеток иммунной системы (в частности, резидентных макрофагов печени — клеток Купфера) сопровождают большинство хронических заболеваний печени. В диагностической практике установить форму фиброза часто возможно только по результатам гистологического исследования [3, 14]. Такое исследование необходимо также при разработке биологических моделей фиброза [15], на доклинической стадии разработки новых лекарственных препаратов [16] и во время клинических испытаний [3, 4]. В настоящем исследовании оптимизированы этапы постановки иммуногистохимической реакции в ранее предложенном протоколе выявления клеток Купфера с помощью антител к микроглиальному маркеру Iba-1 [8], что позволило использовать для подкраски срезов гистологический краситель анилиновый синий. С целью увеличения специфичности окрашивания коллагеновых волокон после проведения иммуногистохимического исследования и сохранения тинкториальных свойств ткани изучена возможность отказа от этапа теплового демаскирования антигенов.

Процедура теплового демаскирования достаточно часто используется в иммуногистохимических исследованиях, поскольку позволяет увеличить чувствительность методики [17], однако тепловая обработка может приводить к нарушению тинкториальных свойств изучаемой ткани, что искажает результаты последующей гистологической окраски. Так, показано, что в процессе термической обработки коллагена происходят денатурация полипептидных цепей и разрыв связей между ними. Денатурация коллагена является многоэтапным процессом, сопровождающимся нарушением специфической конфигурации молекул глицина, пролина, аланина [18, 19].

Исключение этапа теплового демаскирования в представленной в данном исследовании методике иммуногистохимического окрашивания позволило избежать денатурации коллагена на срезах, что дает возможность изучения тканевых макрофагов и выявления волокон соединительной ткани в пределах одного среза. Это предоставляет исследователю способы изучения их взаимного расположения и более полной оценки функционального состояния органа.

При использовании иммуногистохимических методов окрашивания [20] для выявления коллагеновых волокон часто возможно неспецифическое окрашивание клеточных элементов исследуемого образца ткани, а также усложнение процесса постановки реакций, требующих двух хромогенов. Коллаген не является консервативным белком: считается, что разнообразие его структурных вариантов у разных видов животных обусловлено вариабельностью аминокислотной последовательности, а также связано с типом коллагена [21]. В связи с этим подбор первичных антител для каждого вида и исследуемого типа коллагена представляется трудоемким и финансово затратным.

Напротив, классические гистологические методы окрашивания межклеточного вещества соединительной ткани, по сравнению с иммуногистохимическими, имеют свои преимущества и могут оказаться более приемлемыми для исследователя. Благодаря универсальности в выявлении коллагенов различных типов и высокой аффинности анилиновый синий в сочетании с предварительной обработкой фосфорномолибденовой или фосфорновольфрамовой кислотой является часто применяемым красителем при исследованиях коллагена в различных органах и тканях [3, 5, 22, 23]. Все эти факты обусловили выбор для настоящей методики в качестве гистохимического красителя анилинового синего, который позволил специфично выявлять коллагеновые волокна соединительной ткани. Установлено, что метод с применением данного красителя подходит для комбинированного использования с иммуногистохимическими методами выявления макрофагов и последующего морфометрического анализа.

Заключение

Оптимизация разработанного протокола выявления клеток Купфера с помощью антител к микроглиальному маркеру Iba-1 позволяет одновременно идентифицировать резидентные макрофаги печени и волокна коллагена без использования этапа теплового демаскирования. Представленная методика окрашивания дает возможность эффективно применять морфометрический анализ, включающий бинаризацию, сегментацию по цветовому каналу, определение площади объектов и их числа, расчет площади структур с использованием морфометрической сетки.

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.