Композиция поли-D,L-лактида-со-гликолида и эноксапарина натрия — перспективное покрытие сосудистых стентов: оценка биосовместимости и эффективности стент-графтов в эксперименте на крупных животных

Введение

Заболевания системы кровообращения продолжают занимать лидирующие позиции среди причин смертности трудоспособного населения, при этом значительная часть летальных исходов (до 50%) приходится на ишемическую болезнь сердца [1–4]. В связи с этим своевременная диагностика и эффективное лечение сердечно-сосудистых заболеваний остаются одной из приоритетных задач современной медицины.

Восстановление коронарного кровотока может быть осуществлено как методами «открытой» хирургии, так и путем использования малоинвазивных эндоваскулярных вмешательств. Однако в последние десятилетия рентгенэндоваскулярные методы значительно опередили аортокоронарное шунтирование по числу выполняемых процедур, что обусловлено их меньшей травматичностью, сокращением сроков реабилитации и хорошими клиническими исходами. В частности, при лечении пациентов с острым коронарным синдромом соотношение аортокоронарного шунтирования и чрескожных коронарных вмешательств (ЧКВ) составляет 8–12% и 50–60% соответственно [2].

С развитием технологий рентгенэндоваскулярной хирургии наблюдается неуклонный рост количества вмешательств не только на коронарных артериях, но и на сосудах других бассейнов, включая брахиоцефальные, интра- и экстракраниальные артерии, а также артерии нижних конечностей. В таких процедурах широко применяются различные конструкции стентов, позволяющие обеспечивать восстановление кровотока в пораженных сосудах [2]. Однако, несмотря на значительные достижения в области рентгенэндоваскулярной хирургии, проблема осложнений, возникающих как при лечебных, так и при диагностических вмешательствах, остается актуальной [5–7].

Одним из наиболее опасных осложнений ЧКВ является ятрогенная перфорация коронарных артерий, частота которой, по данным клинических исследований, составляет 0,2–0,6% всех вмешательств [6]. Риск возникновения данных осложнений увеличивается пропорционально сложности выполняемой процедуры: при рутинном ЧКВ частота их составляет около 0,43%, тогда как при вмешательствах, направленных на реканализацию хронических окклюзий коронарных артерий, этот показатель возрастает до 2,9% [7]. Наибольшему риску развития перфорации подвержены пациенты с выраженной извитостью сосудов и наличием кальцифицированных бляшек, что значительно затрудняет проведение процедуры.

Перфорация коронарных артерий сопряжена с высоким риском жизнеугрожающих осложнений, включая тампонаду сердца, массивные кровоизлияния и кардиогенный шок. Летальность данных осложнений достигает 10,7% [5], что обусловливает актуальность поиска новых методов профилактики и лечения ятрогенных перфораций, а также совершенствования эндоваскулярных технологий, направленных на снижение риска таких осложнений.

Для остановки кровотечений труднодоступных артерий оптимальным решением является использование стент-графтов, т.е. стентов, имеющих с внешней стороны покрытие, закрывающее диссекцию/перфорацию артерии и восстанавливающее кровоток. В настоящее время на рынке представлены стент-графты с покрытием из различных материалов: недеградируемых полимеров (например, политетрафторэтилен, полиуретан) и биологических тканей (например, перикард лошади) [8–10]. При этом недеградируемые полимеры, как и биоматериалы, остаются в стенке артерии на долгое время и могут вызывать хроническое воспаление и, как следствие, нередко приводить к кальцификации в зоне имплантации [11, 12].

Биодеградируемые полимеры, особенно с коротким сроком резорбции, могут служить более успешной альтернативой, поскольку, выполнив свою защитную функцию при закрытии перфорации и во время ремоделирования перфорированной артерии, далее деградируют, не вызывая хронического воспаления. При этом в полимерное покрытие можно включать лекарственные препараты по принципу производства стентов с лекарственным покрытием: лекарственное вещество будет дозированно выделяться по мере деградации полимерной композиции и оказывать локальное терапевтическое действие.

Ранее [13, 14] нами был проведен скрининг различных полимеров с целью создания стент-графта с позиции упругодеформативных свойств, био- и гемосовместимости. Сополимер поли-D,L-лактид-со-гликолид с соотношением полилактида и гликолида 50:50 был выбран как наиболее оптимальный, отвечающий всем требованиям: сохранность покрытия при раздувании баллоном, высокая био- и гемосовместимость и короткие сроки биодеградации — не более 3 мес. Для нанесения покрытия использован метод электроспиннинга, который позволяет равномерно наносить покрытие требуемой толщины, включать лекарственные вещества в состав микроволокон, что приводит к их дозированному выделению после имплантации по мере деструкции полимерной нити. В качестве лекарственного вещества был выбран низкомолекулярный гепарин — эноксапарин натрия, поскольку помимо антитромботических и антикоагулянтных свойств он обладает также противовоспалительным действием [15].

Для оценки клинической эффективности выбранного покрытия in vivo решено имплантировать стент-графты в артерию крупного животного с последующей оценкой рисков тромбозов, рестенозов, а также реакции окружающих тканей на полимерное покрытие.

Цель исследования — оценить в эксперименте на крупных животных биосовместимость сосудистых стентов, покрытых мембраной на основе сополимера поли-D,L-лактида-со-гликолида и эноксапарина натрия.

Материалы и методы

Для покрытия биополимерной мембраной были использованы металлические коронарные стенты «Калипсо» («Ангиолайн», Россия) длиной 8 мм, диаметром 4 и 4,5 мм. Для получения покрытия готовили 15% раствор сополимера поли-D,L-лактида-со-гликолида с молекулярной массой 30 000–45 000 г/моль и соотношением лактида и гликолида 50:50 («Новохим», Россия), растворенного в гексафторпропаноле (1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол), чистота ≥99,8% (Sigma-Aldrich, США). Полимер размешивали на магнитной мешалке в течение 12 ч при комнатной температуре до полного растворения. Для придания гемосовместимости и снижения риска тромбоза в раствор полимера добавляли низкомолекулярный гепарин Эниксум (эноксапарин натрия), после чего размешивали раствор еще в течение 30 мин. Стенты размещали на металлическом штифте диаметром 1,0 мм (рис. 1, а). Полимерное покрытие наносили методом электроспиннинга (рис. 1, б) на установке Nanon-01A (MECC CO, Япония). При помощи стереомикроскопа оценивали качество нанесенного покрытия (рис. 1, в). Толщина полимерного покрытия составляла 80–90 мкм. После высыхания стент-графт помещали на баллон (рис. 1, г) и стерилизовали методом радиационного излучения.

---

Рис. 1. Подготовка стент-графтов для имплантации: а — размещение стентов на металлическом штифте; б — нанесение покрытия методом электроспиннинга; в — оценка качества нанесенного покрытия при помощи стереомикроскопа; г — фиксация стент-графта на баллоне

---

Основные этапы исследования:

1) имплантация стент-графта во внутреннюю сонную артерию лабораторного животного с предварительной оценкой состояния нативного сосуда с помощью внутрисосудистого ультразвукового исследования (ВСУЗИ) под контролем цветного дуплексного сканирования (ЦДС);

2) динамическое наблюдение при помощи ЦДС, контрольные точки — 3-й день, 1 и 3 мес;

3) эксплантация стент-графтов через 3 мес;

4) гистологическое исследование эксплантатов.

Экспериментальные исследования проведены в соответствии с Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 2011); с принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 2006); Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (2024) и одобрены Локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний (протокол №11 от 20.11.2023 г.).

С целью профилактики раннего тромбоза стент-графта перед оперативным вмешательством накануне вечером лабораторному животному давали нагрузочную дозу 300 мг клопидогрела и 300 мг ацетилсалициловой кислоты. Операции проведены в условиях эндотрахеального наркоза. Покрытые полимерной мембраной стент-графты имплантированы животным во внутреннюю сонную артерию с двух сторон. В эксперименте участвовали овцы (n=5) массой 32–35 кг. Использовано 7 стент-графтов (опытная группа) и 3 стента без покрытия (контрольная группа). Неравное количество стентов в группах обусловлено тем, что результаты имплантации стентов без покрытия ранее уже описаны в работе [16]. Кроме того, в экспериментальном исследовании [17] мы подтвердили уже имеющиеся данные работы [16]. Имплантация стентов с разработанным биополимерным покрытием предусматривала тщательный анализ, что потребовало увеличения количества наблюдений.

Имплантацию стент-графта в общую сонную артерию выполняли следующим образом. После введения экспериментального животного в наркоз с использованием аппарата УЗИ с функцией ЦДС Mindray M5 (Mindray, Китай) визуализировали общую сонную артерию (рис. 2, а) с последующей ее пункцией и установкой интродьюсера 6 Fr (рис. 2, б). После системного введения гепарина (2500 ЕД) для оценки референсного диаметра сосуда и выбора необходимого размера стента или графта (рис. 2, в) использовали систему ВСУЗИ iLab Polarisс датчиками OptiCross (Boston Scientific, США). Измерение диаметра артерии двумя различными методами показало существенную разницу: при использовании ВСУЗИ диметр артерии был в среднем на 0,8–1,0 мм больше, чем при предварительном измерении с помощью УЗИ. На основании показателей ВСУЗИ выбирали диаметр стент-графта.

---

Рис. 2. Процесс имплантации стент-графта в сонную артерию: а — ультразвуковая визуализация общей сонной артерии; б — установка интродьюсера; в — оценка референсного диаметра сосуда с помощью датчика внутрисосудистого ультразвукового исследования; г — контроль качества раскрытия стент-графта с помощью внутрисосудистого ультразвукового исследования

---

После этого параллельно датчику ВСУЗИ дистальнее на 0,5–1,0 см заводили стент-графт. После позиционирования под контролем чрескожного и внутрисосудистого УЗИ стент-графт имплантировали в общую сонную артерию. Затем проводили контроль раскрытия стент-графта с помощью ВСУЗИ, при выявлении мальпозиции и/или недораскрытия выполняли постдилатацию баллоном (до 16 атм) с повторной оценкой результата. Методом ВСУЗИ оценивали площадь раскрытия, аппозицию, а также наличие диссекций (рис. 2, г).

После имплантации стент-графта удаляли баллон и интродьюсер, отверстие герметизировали с помощью ушивающего устройства Angio-Seal (Terumo Medical Corporation, США).

В интраоперационный период всем животным вводили антибиотик цефтриаксон (750 мг однократно). В послеоперационном периоде им назначали следующую терапию: инъекции цефуроксима (по 750 г 2 раза в сутки в течение до 5 сут после операции); кетопрофена 50 мг/мл (по 2 мл внутримышечно 2 раза в сутки в течение до 5 сут после операции); двойная антиагрегантная терапия до 90 сут после операции: клопидогрел (75 мг перорально) и ацетилсалициловая кислота (75 мг перорально).

Функциональность стентов оценивали методом ЦДС на 3-и сутки, а также через 1 и 3 мес после операции. Вывод животных из эксперимента осуществляли через 3 мес после имплантации стента. Для сравнения в качестве эталона был забран фрагмент интактной (нативной) сонной артерии, примыкающей к стент-графту. Эксплантированные стент-графты/стенты подвергли макро- и микроскопическому исследованию. Интеграцию стентов с сонной артерией, наличие воспалительной реакции, характер деградации полимерного покрытия, особенности образования неоинтимы оценивали оригинальным методом EM-BSEM, который заключается в заливке цельных фрагментов эксплантированного материала в эпоксидную с смолу с последующим изучением с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в обратно-рассеянных электронах [17]. Этот метод позволяет получать микрофотографии высокого разрешения, визуально сходные со снимками, сделанными при просвечивающей электронной микроскопии.

Для этого удаленные комплексы «стент–сонная артерия» и фрагмент интактной артерии, примыкающей к имплантированному стент-графту, промывали в охлажденном физиологическом растворе хлорида натрия и помещали в забуференный (рН 7,4) 10% водный раствор формалина (B06-003; «БиоВитрум», Россия) на 24 ч с однократной сменой формалина через первые 12 ч. На следующем этапе образцы постфиксировали в 1% тетраоксиде осмия (19110; Electron Microscopy Sciences, США), приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере, в течение 12 ч, и далее окрашивали 2% водным раствором тетраоксида осмия в течение 48 ч. Затем образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80, 95%) — по две 15-минутных смены в каждой из указанных концентраций. После этого образцы докрашивали 2% спиртовым (95% этанол) раствором уранилацетата (22400-2; Electron Microscopy Sciences, США) в течение 5 ч и обезвоживали в изопропаноле (06-002; «БиоВитрум», Россия) в течение 5 ч и ацетоне (150495; «ЛенРеактив», Россия) в течение 1 ч. Затем образцы пропитывали смесью эпоксидной смолы Araldite 502 (13900; Electron Microscopy Sciences) и ацетона в соотношении 1:1 в течение 6 ч, чистой эпоксидной смолой в течение 24 ч и полимеризовали в свежей эпоксидной смоле в емкостях FixiForm (40300085; Struers, Дания) при 60°C в течение 24 ч. Получившиеся эпоксидные блоки шлифовали до поверхности образца и полировали на установке TegraPol-11 (Struers, Дания) с последовательным использованием шлифовальных дисков с диаметром зерна 9, 6 и 3 мкм. После полировки образцы контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (17810; Electron Microscopy Sciences, США) в течение 15 мин путем нанесения раствора на отполированную поверхность блока. После отмывки в бидистиллированной воде на эпоксидные блоки наносили углеродное напыление толщиной 10–15 нм с помощью вакуумной напылительной системы EM ACE200 (Leica, Германия).

Визуализацию структуры образцов выполняли при помощи СЭМ в режиме вторичных (обратно-рассеянных) электронов на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 10 или 15 кВ.

Результаты и обсуждение

С целью оценки проходимости установленных стентов и стент-графтов на 3-и сутки, через 1 и 3 мес всем животным проводили УЗИ. Полученные результаты подтвердили проходимость всех имплантированных изделий: стенты и стент-графты визуализировались хорошо, отчетливо были видны балки (страты) (рис. 3, а). Кровоток через имплантированный стент-графт сохранен (рис. 3, б). Случаев тромбоза не зафиксировано.

---

Рис. 3. Ультразвуковой контроль проходимости стент-графта: а — визуализация балок (стратов) стент-графта; б — подтверждение кровотока через стент-графт

---

После эксплантации отмечена деформация имплантированных изделий: стенты и стент-графты принимали овальную форму вместо ожидаемой круглой. Данный факт обусловлен тем, что сонная артерия находится близко к коже, а коронарные стенты, используемые в данном исследовании, достаточны хрупкие. Это и привело к сжатию стента и принятию им овальной формы при проведении УЗИ в динамике из-за прижатия датчика плотно к коже животного. Необходимо отметить, что кровоток через деформированный стент был сохранен и случаев тромбоза стента либо стент-графта не отмечено.

При сравнении методом СЭМ состояния интактной артерии, примыкающей к имплантированному стент-графту, и фрагмента артерии с имплантированным стент-графтом, установлено, что строение слоев артерий схоже: отчетливо визуализируются интима/неоинтима, слои медии и адвентиции (рис. 4). При увеличении в 100 раз видно, что размеры слоев медии и адвентиции в среднем составили 250 и 200 мкм соответственно как в интактной артерии, так и в артерии, содержащей стент-графт (рис. 4, б, г). Различались только размеры внутреннего слоя: толщина интимы в интактной артерии не превышала 85 мкм, в то время как толщина неоинтимы в зоне имплантации стент-графта была в 2 раза больше и достигала 165 мкм.

---

Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия интактной артерии (а, б) и эксплантированного стент-графта (в, г) Желтым цветом выделена зона интимы/неоинтимы, красным— медия, голубым — адвентиция; ×50 (а, в); ×100 (б, г)

---

При этом следует отметить, что неоинтима была равномерной, плотноупакованной, на поверхности встречались единичные эндотелиальные клетки. Признаки пристеночного тромбоза отсутствовали во всех образцах. В отличие от интактной артерии внутренняя эластическая мембрана в артерии со стент-графтом не визуализируется по причине ее сжатия стентом при имплантации.

Совсем иную картину наблюдали при сравнении артерий с имплантированными стентами без покрытия биополимерной мембраной и с покрытием (рис. 5). Неоинтима в случае имплантации металлического стента без биополимерной мембраны была неравномерной, рыхлой, бугристой (рис. 5, в), достигая местами толщины до 380 мкм (рис. 5, г).

---

Рис. 5. Сканирующая электронная микроскопия фрагментов сонной артерии, включающих: а — имплантированный стент-графт с биополимерным покрытием, б — толщина неоинтимы при имплантации стент-графта (стрелки); в — стент без покрытия; г — толщина неоинтимы при имплантации стента без покрытия (стрелки); ×15 (а, в), ×50 (б, г)

---

При увеличении в 500 раз отчетливо видны балки (страты) стентов и полимерное покрытие, нанесенное изготовителем (рис. 6, а, в). Согласно инструкции, для снижения риска разрастания неоинтимы и рестеноза изготовитель покрывает балки стента биодеградируемым полимером — полилактидом-со-гликолидом с добавлением сиролимуса. Данное покрытие сохранилось через 3 мес имплантации и отчетливо визуализировалось вокруг балок, его толщина составляла 8–9 мкм.

---

Рис. 6. Сканирующая электронная микроскопия фрагментов эксплантированных стент-графта с биополимерным покрытием (а, б) и стента без покрытия (в, г) Желтыми стрелками указано полимерное покрытие балок стента производителем; красными стрелками — клетки воспалительного ряда; голубыми стрелками — фиброзная капсула; ×500 (а, в), ×1000 (б, г)

---

У артерий с имплантированными стентами и стент-графтами различались не только толщина и морфология неоинтимы, но и клеточный состав. Во всех образцах наблюдали классическую картину образования плотной фиброзной капсулы, которая отделяет металлические балки стента от кровотока и структурных элементов артерии. При увеличении в 1000 раз (рис. 6, б, г) видно сохранившееся полимерное покрытие, нанесенное при изготовлении стента, а вокруг — новообразованные ткани, состав которых значительно различается. Балки стента без мембраны окружают многочисленные клетки воспалительного ряда (см. рис. 6, г), балки стент-графтов окружает компактный слой без признаков воспаления (см. рис. 6, б).

Наиболее презентативно выглядят различия в окружении балок стента и стент-графта на больших увеличениях (рис. 7). Окружение балок стент-графтов представлено в основном гладкомышечными клетками, фиброцитами, фрагментами эластической мембраны, расположенными в межклеточном матриксе, клетки воспаления отсутствуют (рис. 7, б). Периферия балок непокрытого стента состоит из макрофагов, фибробластов, встречаются единичные гигантские клетки инородного тела, что свидетельствует о хроническом воспалении (рис. 7, г). На границе фиброзной капсулы также отмечено наличие фибробластов (рис. 7, д).

---

Рис. 7. Сканирующая электронная микроскопия фрагментов эксплантированных стент-графта с биополимерным покрытием (а–в) и стента без покрытия (г–е) Желтыми стрелками отмечены гладкомышечные клетки, голубыми — фиброциты, красными — макрофаги (клетки воспалительного ряда), белыми — клетки эндотелия; в зеленом круге — гигантские клетки инородного тела; ×1000 (а, в, г, е); ×2500 (б, д)

---

На всех образцах стент-графтов через 3 мес после имплантации полимерная мембрана — нанесенное методом электроспиннинга биополимерное покрытие — не визуализируется (рис. 7, а). Можно утверждать, что полимерное покрытие полностью деградировало без образования рубцовой ткани.

Поверхность неоинтимы, обращенной к кровотоку, у изучаемых образцов также существенно различалась: при имплантации стент-графта на поверхности визуализировали ровный слой эндотелиальных клеток (рис. 7, в), в то время как на поверхности стента без покрытия — эндотелиоподобные клетки, под которыми располагался рыхлый субэндотелиальный слой, представленный фибробластами и макрофагами (рис. 7, е).

В случае имплантации стентов без полимерной мембраны наблюдается формирование более рыхлой и утолщенной неоинтимы. Однако разрастание неоинтимы в просвет артерии (в сторону кровотока) оставалось умеренным по сравнению с имплантацией стент-графтов без лекарственного покрытия согласно результатам других исследований [17]. Вероятно, это обусловлено действием сиролимуса, включенного в состав полимерного покрытия стентов «Калипсо».

Существует мнение, что рестеноз сосудов, включая область имплантации стента, связан с пролиферацией сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК), рост которых может стимулироваться стентами с лекарственным покрытием [4]. Этот факт объясняет различие в толщине неоинтимы у разработанных нами стент-графтов и стентов с полимерным покрытием, содержащим сиролимус. Полимерная мембрана на основе поли-D,L-лактида-со-гликолида изолировала металлические элементы стента от внутреннего слоя артерии, препятствуя прямому контакту лекарственного покрытия, содержащего сиролимус, с СГМК. Помимо механического разделения конструкции стента от окружающих тканей положительный эффект также оказал инкорпорированный в полимерную мембрану эноксапарин натрия, оказывая локальный антикоагулянтный и противовоспалительный эффект.

Наши данные согласуются с результатами исследований [15], в которых установлено, что эноксапарин натрия в составе композиционных покрытий стентов снижает скорость апоптоза эндотелиальных клеток и уменьшает локальное воспалительное повреждение при имплантации кроликам.

Следует обратить внимание на еще одно различие между тканями, окружающими стент-графт и стент без покрытия. В последнем случае наблюдалось присутствие фиброкластов — клеток, участвующих в ремоделировании коллагеновых и эластиновых волокон в процессе репаративной регенерации. Фиброкласты содержат большое количество лизосом, которые выделяют лизосомальные ферменты и, разрушая коллаген и эластин, способствуют их перестройке и формированию рубцов в зоне повреждения [18]. Напротив, в тканях, окружающих стенты с биодеградируемой мембраной, обнаружены лишь единичные фиброциты (конечная форма фибробластов) и СГМК, что может свидетельствовать о завершении репаративного процесса через 3 мес после имплантации.

Выбор трехмесячного периода наблюдения обусловлен характеристиками используемого сополимера, который обладает высокой скоростью гидролитической деградации за счет низкой молекулярной массы [19]. Мы подтвердили это свойство как в случае с подкожной имплантацией [14], так и в настоящем исследовании. По истечении 3 мес следов полимерной мембраны между металлическими элементами стента и стенкой артерии не обнаружено.

Гистологическая картина также свидетельствует о минимальной воспалительной реакции при использовании сополимера в соотношении полилактида и гликолида 50:50 по сравнению с другими соотношениями, например с покрытиями стентов сополимерами с более высоким содержанием полилактида, когда к концу 3-го месяца полимер сохранял целостность [19].

Заключение

Экспериментальное исследование на крупных животных показало, что разработанное полимерное покрытие сосудистого стента на основе сополимера поли-D,L-лактида-со-гликолида с соотношением полилактида и гликолида 50:50 и низкомолекулярного эноксапарина натрия является весьма эффективным. При имплантации в сонную артерию овцы стент-графт с таким покрытием предотвращает тромбоз и стеноз, способствует успешной интеграции с сосудистой стенкой и не вызывает хронического воспаления.

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках гранта Фонда поддержки молодых ученых в области биомедицинских наук №2024_2 «Разработка стент-графтов с биополимерным покрытием для закрытия перфораций артерий в сердечно-сосудистой хирургии».

Конфликт интересов отсутствует.