Сегодня: 18.07.2019
RU / EN
Последнее обновление: 03.07.2019

Биораспределение конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с наночастицей бора для задач бор-нейтронозахватной терапии

А.Б. Воловецкий, Н.Ю. Шилягина, В.В. Дуденкова, С.О. Пасынкова, М.А. Грин, А.Ф. Миронов, А.В. Феофанов, И.В. Балалаева, А.В. Масленникова

Ключевые слова: бор-нейтронозахватная терапия; хлорин е6; конъюгат; фотосенсибилизатор; лазерная сканирующая микро­скопия.

Цель исследования — изучение биораспределения конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта как потенциального транспортера бора для решения задач бор-нейтронозахватной терапии.

Материалы и методы. Работа выполнена на мышах линии Balb/c с привитой опухолью мышиной карциномы толстой кишки CT-26. Конъюгат аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта вводили внутривенно в дозе 5 и 10 мг/кг массы тела. Забор образцов для микроскопического исследования накопления препарата в органах и тканях ex vivo проводили через 3 ч после введения.

Результаты. Характеристичный пик флюоресценции наноконъюгата обнаружен в большинстве исследованных органов, при этом была отмечена значительная избирательность накопления соединения. Высокий уровень накопления был зарегистрирован в печени, почках, селезенке и легочной ткани. При введении препарата в дозе 5 мг/кг содержание его в опухоли практически не отличалось от содержания в мышечной ткани и коже; максимальное накопление отмечалось в печени. При повышении дозы до 10 мг/кг содержание наноконъюгата в опухоли оказалось сравнимым с его содержанием в печени, а отношение сигналов флюоресценции опухоль/мышца составило ~3.

Заключение. Выявлена перспективность использования конъюгата фотосенсибилизатора (хлорина е6) с частицами бора в качестве средства доставки бора в опухоль. Уровень накопления препарата в опухолевой ткани зависит от дозы.


Бор-нейтронозахватная терапия (БНЗТ) — метод лучевой терапии злокачественных новообразований, характеризующийся чрезвычайно высокой биологической эффективностью за счет целенаправленной доставки энергии излучения непосредственно в опухолевые клетки. Данный метод основан на относительно избирательном накоплении в раковых клетках нерадиоактивного изотопа 10В и его последующей активации потоком тепловых нейтронов [1, 2]. Несмотря на высокую эффективность метода, продемонстрированную в эксперименте и клинике [3], до настоящего времени БНЗТ не может перешагнуть рамки клинических испытаний. Этому есть несколько причин, но одна из основных — отсутствие эффективных методов доставки бора в опухолевые клетки. Единственные разрешенные для клинического применения соединения (L-p-дигидроксиборилфенилаланин — BPA и динатриевая соль меркаптоундекагидро-клозо-додекабората — BSH) не обладают высокой селективностью накопления в опухолевой ткани [4–7].

Для решения задачи направленной доставки бора в опухолевые клетки предложены различные стратегии синтеза конъюгатов борсодержащих соединений с биологически активными молекулами, способными накапливаться в опухолевых клетках (предшественники нуклеиновых кислот, аминокислоты и пептиды, углеводы, акридины, различные полиамины, а также порфирины и фталоцианины) [1, 2, 8, 9]. Одним из наиболее перспективных направлений в области создания препаратов для БНЗТ является использование конъюгатов порфиринов с полиэдрическими соединениями бора. Изучение борированных порфиринов для БНЗТ впервые было проведено в 1988 г. G. Oenbrinkс соавт. Установлено, что порфирины и их борные производные способны накапливаться во многих солидных опухолях и представляют собой препараты «двойного назначения»: как агенты доставки бора и как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии [10]. Данный класс соединений представляет собой связанные через линкер хлорин и борный полиэдр [11]. Его представители эффективно накапливаются в опухолевых клетках, а использование карборанов в качестве борного элемента в молекуле дает возможность увеличить концентрацию изотопа в опухоли и обеспечивает стабильность борной части [12].

Необходимым этапом, предшествующим клиническим испытаниям, является исследование фармакокинетики борсодержащих порфиринов, оценка их способности накапливаться и задерживаться в опухоли в более высокой концентрации по сравнению с нормальными тканями, а затем выводиться из организма. Поскольку изотоп 10B не является радиоактивным, он не может быть использован в качестве радиоактивной метки и детектирован с помощью соответствующих методов. В этой ситуации ключевым преимуществом борсодержащих порфиринов является их способность флюоресцировать, что значительно облегчает анализ локализации и распределения препарата в клетках и живых организмах с использованием методов флюоресцентного имиджинга ex vivo и in vivo [13, 14]. Данные методы позволяют исследовать биораспределение флюорофора в организме, оценивая его накопление в опухоли и нормальных тканях.

Цель исследования — изучение биораспределения конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта как потенциального транспортера бора для решения задач бор-нейтронозахватной терапии.

Материалы и методы

Исследуемое соединение, конъюгат аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта (длина аминоалкиламидного линкера n=6) (рис. 1, а), было синтезировано разработанным нами ранее способом [15].


volovetsky-ris-1.jpg
Рис. 1. Структурная формула: черные шарики С-Н, белые шарики В-Н, серый шарик В (а), а также спектры поглощения ε и флюо­ресценции Iфл конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта (б)

Спектры поглощения и флюоресценции конъюгата оценивались на спектрофотометре-спектрофлюориметре Synergy MX (BD, США).

Животные и опухолевая модель. Эксперименты in vivo проводили в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Исследование было одобрено Этическим комитетом Нижегородского государст­венного университета им. Н.И. Лобачевского. Анализ биораспределения борсодержащего конъюгата был выполнен на мышах линии Balb/c (самки, 18–20 г, n=9), полученных из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Пущино Московской области). Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом дне.

Для получения экспериментальных опухолей использовали линию мышиной карциномы толстой кишки CT-26 (номер CRL-2638 по каталогу ATCC®). Культивирование клеток проводили в среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 2 мM L-глутамина («ПанЭко», Россия) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), при 37°С и 5% СО2, в культуральных флаконах площадью 75 см2. На каждом этапе пассирования клетки обрабатывали 0,25% раствором трипсина и версена («ПанЭко», Россия). Субкультивирование выполняли через 2–3 сут по достижении культурой 80% конфлюентности [16].

Для выращивания экспериментальных опухолей животным (n=9) подкожно в область бедра вводили суспензию 1 млн клеток CT-26 в 100 мкл 10 мМ фосфатно-солевого буфера («ПанЭко», Россия). Эксперимент начинали на 9–10-й день после введения, когда диаметр опухолевого узла достигал 9 мм.

В исследовании использовали исходный раствор конъюгата в кремофоре с концентрацией активного вещества 2 мг/мл, который был разбавлен физиологическим раствором до концентрации 1 мг/мл. В контрольной группе (n=3) воздействие препаратом не проводилось. Трем мышам вводили исследуемое вещество в дозе 5 мг/кг массы тела, трем мышам — в дозе 10 мг/кг. Раствор вводили в кровоток через хвостовую вену. Объем инъекции составлял 100 мкл. Через 3 ч после введения борсодержащего конъюгата животных умерщвляли путем дислокации шейных позвонков. Для последующего микроскопического исследования получали образцы следующих органов и тканей: опухоли, поперечно-полосатой мышцы, кожи, печени, почки, селезенки, тонкого кишечника, легких.

Приготовление образцов и микроскопическое исследование. Опухоль целиком препарировали из окружающей ткани и рассекали по продольной оси в плоскости, перпендикулярной поверхности бедра. Разрез мышцы бедра производили вдоль направления волокон, разрез почки — по сагиттальной плоскости органа. Продольные срезы печени, легкого и селезенки делали в толще этих органов. Микроскопический анализ образцов выполняли непосредственно после их получения, без процедуры фиксации или заморозки. На протяжении исследования поддерживали влажность препаратов путем смачивания физиологическим раствором.

Изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Axiovert 200M LSM510 META (Carl Zeiss, Германия) с использованием масло-иммерсионного объектива Plan-Apochromat с увеличением ×40 и числовой апертурой 1.3. Латеральное разрешение изображений составило 1024×1024 пикселя, размер пикселя — 0,22 мкм. Флюоресценцию конъюгата возбуждали при длине волны 514 нм, сигнал регистрировали с помощью спектрального модуля META в диапазоне 560–710 нм с шагом 10 нм. Спектральная информация позволяла идентифицировать сигнал наноконъюгата на фоне автофлюоресценции тканей. Все изображения получены при идентичных условиях.

Статистическая обработка данных. С помощью программного обеспечения микроскопа из полученного спектрального изображения выделяли канал, соответствующий принимаемому сигналу флюоресценции в диапазоне 650–693 нм. Используя программу ImageJ (версия 1.47v), определяли средний уровень сигнала по площади каждого изображения исследованных образцов опухоли и нормальных тканей. Для каждого образца нормальных тканей анализировали от 3 до 5 полей зрения. При изучении образцов опухолевой ткани случайным образом выбирали поля зрения из центральных и периферических участков опухолевого узла (не менее 5 полей зрения для каждого образца). Данные представлены как среднее значение сигнала в условных единицах ± стандартное отклонение для малых выборок. При сравнении значений использовали однофакторный дисперсионный анализ и критерий Даннета.

Результаты и обсуждение. Первым этапом исследования было изучение оптических свойств полученного конъюгата аминоамидного производного хлорина е6 с бис-дикарболлидом кобальта. Соединение характеризовалось интенсивным поглощением света в видимой области спектра с пиками при 405, 500 и 665 нм, что близко по значениям к пикам хлорина е6 (рис. 1, б). Максимум флюоресценции наблюдался при 670 нм. Эксперименты, проведенные ранее на клеточных культурах [14], показали интенсивное поглощение данного конъюгата опухолевыми клетками линии А549 с коэффициентом накопления клетки/среда 80. Это свойст­во позволяет предположить возможность достижения терапевтической дозы, необходимой для проведения БНЗТ, при большем контрасте с нормальной тканью и меньшей итоговой токсичности in vivo. Результаты, полученные in vitro, послужили основой для начала работы на опухолевых моделях in vivo. Выбор экспериментальной модели CT-26 был обусловлен высокой васкуляризацией формирующейся опухоли [17].

Изучение образцов опухолевой ткани выявило появление в ней интенсивного сигнала флюоресценции (рис. 2, а) при обеих исследованных дозах наноконъюгата через 3 ч после инъекции. Максимум флюоресценции наблюдался при 665–670 нм (рис. 2, б), что соответствует спектру исследуемого конъюгата.


volovetsky-ris-2.jpg
Рис. 2. Изображения образцов ткани опухоли контрольного животного и животного после инъекции наноконъюгата (10 мг/кг, 3 ч после введения) (а), а также спектры флюоресценции Iфл участков, выделенных кружком (б). Размер изображений — 225×225 мкм

Характерной особенностью накопления флюорофора в опухоли была неравномерность его распределения в различных участках (рис. 3). Можно предположить, что данный феномен обусловлен так называемым EPR-эффектом (enhanced permeability and retention effect), т.е. особенностями cосудистого русла опухоли, в том числе неравномерностью и хаотичностью формирующихся сосудов [18].


volovetsky-ris-3.jpg
Рис. 3. Изображение участков с различным накоплением наноконъюгата (1, 2) в ткани опухоли животного после инъекции препарата (10 мг/кг, 3 ч после введения), демонстрирующее неоднородность его распределения (а), а также спектры флюоресценции Iфл этих участков (б). Размер изображения — 125×125 мкм. Цветовая кодировка, как на рис. 2


Характеристичный пик флюоресценции конъюгата был обнаружен в большинстве исследованных органов, при этом была отмечена значительная избирательность накопления соединения (рис. 4). Высокий уровень накопления конъюгата зарегистрирован в печени, почках, селезенке и легочной ткани, что соответствует данным фармакокинетики, полученным для препаратов хлоринового ряда, и связано с морфофункциональными особенностями этих органов [19]. Сигнал конъюгата в скелетных мышцах, а также в мышечных стенках полых органов (желудок, кишечник, сердце) был существенно ниже. Кроме того, отмечено практически полное отсутствие накопления конъюгата в образцах кожи. Через 3 ч после инъекции значительное количество вещества оставалось в кровеносном русле и регистрировалось в крупных сосудах различных органов (для примера на рис. 4 показаны сосуды, питающие скелетную мышцу).


volovetsky-ris-4.jpgРис. 4. Изображения образцов тканей животного через 3 ч после введения наноконъюгата (10 мг/кг). Размер изображений — 225×225 мкм. Цветовая кодировка, как на рис. 2

Количественный анализ уровня сигнала флюоресценции в образцах тканей позволил выявить зависимость накопления наноконъюгата от введенной дозы препарата. После введения препарата в дозе 5 мг/кг содержание его в опухоли практически не отличалось от содержания в мышечной ткани и коже; максимальное накопление препарата отмечалось в печени (рис. 5).


volovetsky-ris-5.jpg
Рис. 5. Уровень сигнала флюоресценции Iфл образцов тканей у контрольных животных и животных с введением различных доз наноконъюгата. * — статистически значимое отличие от контроля

При повышении дозы до 10 мг/кг содержание наноконъюгата в опухоли оказалось сравнимым с его содержанием в печени, а отношение сигналов флюоресценции опухоль/мышца составило ~3. Необходимо отметить высокое значение стандартного отклонения уровня сигнала в опухоли при введении наноконъюгата в дозе 10 мг/кг, что соответствует результатам микроскопического исследования, когда в опухоли были выявлены участки как с очень высоким, так и со средним по величине сигналом (см. рис. 3).

Таким образом, предварительное исследование показало, что изученный борсодержащий конъюгат хлорина в достаточной мере отвечает тем требованиям, которые предъявляются к препаратам для БНЗТ [2]. В частности, соединение продемонстрировало способность к относительно селективному накоплению в опухоли с соотношением его содержания «опу­холь/нормальная ткань» как 3:1. Препарат продемонстрировал низкое накопление в коже, что позволяет предположить низкую фототоксичность и безопасность применения препарата на свету. Способность хлорина флюоресцировать дает возможность контроля содержания бора в тканях методами in vivo. Данные факты позволяют сделать вывод о перспективности использования борсодержащих конъюгатов в качестве агентов доставки бора для БНЗТ. Следующим этапом работы будет исследование фармакокинетики конъюгата, а также анализ содержания бора в опухоли и нормальных тканях с целью разработки оптимальных режимов введения препарата и последующего радиационного воздействия.

Заключение. Исследование биораспределения конъюгата фотосенсибилизатора (хлорина е6) с бис-дикарболлидом кобальта продемонстрировало перспективность его использования в качестве средст­ва доставки бора в опухоль. Уровень накопления препарата в опухолевой ткани зависит от введенной дозы.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке проекта РФФИ №14-02-00715.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутст­вии конфликта интересов.


  1. Sivaev I.B., Bregadze V.I., Kuznetsov N.T. Derivatives of the closo-dodecaborate anion and their application in medicine. Russian Chemical Bulletin 2002; 51(8): 1362–1374, http://dx.doi.org/10.1023/A:1020942418765.
  2. Розуменко В.Д. Бор-нейтронозахватная терапия опухолей головного мозга. Украинский нейрохирургический журнал 2001; 3: 4–12.
  3. Hartman T., Carlson J. Radiation dose heterogeneity in receptor and antigen mediated boron neutron capture therapy. Radiother Oncol 1994; 31(1): 61–75, http://dx.doi.org/10.1016/0167-8140(94)90414-6.
  4. Boron chemistry at the beginning of the 21st century. Bubnov Yu.N. (editor). Moscow: Editorial URSS; 2003; 376 p.
  5. Soloway A.H., Tjarks W., Barnum B.A., Rong F.G., Barth R.F., Codogni I.M., Wilson J.G. The chemistry of neutron-capture therapy. Chem Rev 1998; 98(4): 1515–1562, http://dx.doi.org/10.1021/cr941195u.
  6. Yokoyama K., Miyatake S., Kajimoto Y., Kawabata S., Doi A., Yoshida T., Asano T., Kirihata M., Ono K., Kuroiwa T. Pharmacokinetic study of BSH and BPA in simultaneous use for BNCT. J Neurooncol 2006; 78(3): 227–232, http://dx.doi.org/10.1007/s11060-005-9099-4.
  7. Goudgaon N.M., El-Kattan G.F., Schinazi R.F. Boron containing pyrimidines, nucleosides, and oligonucleotides for neutron capture therapy. Nucleosides and Nucleotides 1994; 13(1–3): 849–880, http://dx.doi.org/10.1080/15257779408013283.
  8. Neutron capture therapy — principles and application. Sauerwein W., Wittig A., Moss R., Nakagawa Y. (editors). Springer Science + Business Media; 2012, http://dx.doi.org/10.1007/978-3-642-31334-9.
  9. Yamamoto Y., Cai J., Nakamura H., Sadayori N., Asao N., Nemoto H. Synthesis of netropsin and distamycin analogues bearing o-carborane and their DNA recognition. Journal of Organic Chemistry 1995; 60(11): 3352–3357, http://dx.doi.org/10.1021/jo00116a018.
  10. Oenbrink G., Jurgenlimke P., Gabel D. Accumulation of porphyrins in cells influence of hydrophobicity aggregation and protein binding. Photochem Photobiol 1988; 48(4): 451–456, http://dx.doi.org/10.1111/j.1751-1097.1988.tb02844.x.
  11. Grin M.A., Titeev R.A., Brittal D.I., Chestnova A.V., Mironov A.F., Feofanov A.V., Lobanova I.A., Sivaev I.B., Bregadze V.I. Synthesis of cobalt bis(dicarbollide) conjugates with natural chlorins by the Sonogashira reaction. Russian Chemical Bulletin 2010; 59(1): 219–224, http://dx.doi.org/10.1007/s11172-010-0065-8.
  12. Efremenko A.V., Ignatova A.A., Grin M.A., Mironov A.F., Bregadze V.I., Sivaev I.B., Feofanov A.V. Confocal microscopy and spectral imaging technique: contribution to the development of neutron sensitizers for anticancer BNCT. In: Current microscopy contributions to advances in science and technology. A. Méndez-Vilas (editor). Spain: FORMATEX, 2012; p. 84–90.
  13. Ol'shevskaya V.A., Zaytsev A.V., Savchenko A.N., Shtil A.A., Cheong C.S., Kalinin V.N. Boronated porphyrins and chlorins as potential anticancer drugs. Bulletin of the Korean Chemical Society 2007; 28(11): 1910–1914.
  14. Efremenko A.V., Ignatova A.A., Grin M.A., Sivaev I.B., Mironov A.F., Bregadze V.I., Feofanov A.V. Chlorin e6 fused with a cobalt-bis(dicarbollide) nanoparticle provides efficient boron delivery and photoinduced cytotoxicity in cancer cells. Photochem Photobiol Sci 2014; 13(1): 92–102, http://dx.doi.org/10.1039/c3pp50226k.
  15. Grin M.A., Titeev R.A., Brittal D.I., Ulybina O.V., Tsiprovskiy A.G., Berzina M. Ya., Lobanova I.A., Sivaev I.B., Bregadze V.I., Mironov A.F. New conjugates of cobalt bis(dicarbollide) with chlorophyll a derivatives. Mendeleev Communications 2011; 21(2): 84–86, http://dx.doi.org/10.1016/j.mencom.2011.03.008.
  16. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство. М: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2010; 691 с.
  17. Kuznetsov S.S., Snopova L.B., Karabut М.М., Sirotkina М.А., Buyanova N.L., Kalganova Т.I., Elagin V.V., Senina-Volzhskaya I.V., Barbashova L.N., Shumilova A.V., Zagaynova E.V., Vitkin A., Gladkova N.D. Features of morphological changes in experimental ct-26 tumors growth. Sovremennye tehnologii v medicine 2015; 7(3): 32–39, http://dx.doi.org/10.17691/stm2015.7.3.04.
  18. Maeda H. Macromolecular therapeutics in cancer treatment: the EPR effect and beyond. Journal of Controlled Release 2012; 164(2): 138–144, http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.038.
  19. Juzeniene A. Chlorin e6-based photosensitizers for photodynamic therapy and photodiagnosis. Photodiagnosis Photodyn Ther 2009; 6(2): 94–96, http://dx.doi.org/10.1016/j.pdpdt.2009.06.001.


Журнал базах данных

web_of_science.jpg

scopus.jpg

crossref.jpg

doaj.jpg

ebsco.jpg

embase.jpg

ulrich.jpg

cyberleninka.jpg

e-library.jpg

lan.jpg

ajd.jpg

vak.jpg