Молекулярные маркеры BЭБ- и ВГЧ6-ассоциированного мононуклеоза

Введение

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ, Human gammaherpesvirus 4) и вирус герпеса человека тип 6 (ВГЧ6, Human betaherpesvirus 6) — представители семейства Herpesviridae, являющиеся возбудителями инфекционного мононуклеоза (ИМ). Оба вируса обладают тропностью к широкому спектру субпопуляций иммунокомпетентных клеток, оказывают влияние на их содержание в крови пациентов [1], а также могут вносить существенный вклад в развитие лимфопролиферативных заболеваний [2–4]. На сегодняшний день эффективные таргетные методы терапии не разработаны.

На молекулярном уровне воздействие вирусов реализуется путем модуляции экспрессии генов, участвующих в активации клеток иммунной системы, их пролиферации, дифференцировке и апоптозе. Выраженное изменение экспрессии набора генов, контролирующих указанные процессы, может служить своеобразным уникальным молекулярным паспортом ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ, а отдельные гены — маркерами инфекции. Такие маркеры можно использовать с целью диагностики и мониторинга заболеваний, а также в качестве потенциальной терапевтической мишени [5–8].

С применением технологии ДНК-биочипов (DNA microarray) можно оценить не только экспрессию гена (суммарный уровень представленности всех его мРНК), но и состав, а также количественное соотношение его транскриптов (сплайсированных вариантов мРНК одного гена). Учитывая оптимальное соотношение стоимости исследования, производительности и точности результатов, ДНК-биочипы часто становятся технологией первого выбора при проведении поисковых работ, целью которых является обнаружение новых молекулярно-генетических маркеров широкого спектра заболеваний [9]. Анализ результатов, полученных с помощью ДНК-биочипов, так же как и с помощью методов высокопроизводительного секвенирования, требует привлечения сложного математического аппарата, сочетающего методы прикладной статистики и алгоритмы машинного обучения [10].

Целью данной работы стало выявление набора молекулярно-генетических маркеров ВЭБ- и ВГЧ6-ассоциированной инфекции в лейкоцитах крови пациентов с инфекционным мононуклеозом.

Материалы и методы

Дизайн и синтез ДНК-биочипа. Для анализа экспрессии мРНК генов — участников основных клеточных процессов — нами сконструированы ДНК-биочипы. Селекцию дискриминирующих зондов, являющихся функциональной основой биочипа, производили с использованием алгоритма «Splice variants microarray design pipeline» [11]. Всего выбрано 1115 зондов, из которых 403 позволяют оценивать экспрессию генов, а 712 детектируют уровни представленности индивидуальных транскриптов. Полный перечень генов и их транскриптов представлен в дополнительных материалах (см. Приложение 1, https://drive.google.com/file/d/1xKS_MvENloPYKwuzeC1LaqFTH3i130So/view). Также в дизайн ДНК-биочипа включены 70 зондов негативного контроля, подобранных на основе генома бактерии Rhizobium rubi. Синтез зондов на биочип осуществляли in situ с помощью оборудования B3 Synthesizer и соответствующего комплекта реагентов в соответствии с рекомендациями производителя (CustomArray Inc., США).

Отбор исследуемых групп. В исследовании приняли участие дети и подростки 7–18 лет с диагнозом «острый инфекционный мононуклеоз», а также практически здоровые добровольцы, сопоставимые по полу и возрасту. В крови и сыворотке крови участников определяли наличие специфических антител к ВЭБ, ВГЧ6 и цитомегаловирусу (ЦМВ), а также наличие ДНК этих возбудителей. Использовали коммерческие наборы для иммуноферментной диагностики: «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-VCA-IgG», «ВектоHHV-6-IgG», «ВектоЦМВ-IgM», «ВектоЦМВ-IgG» («Вектор-Бест», Россия) и коммерческий набор для ПЦР в режиме реального времени «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-cкрин-FL» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Россия).

По результатам обследования были выделены группы: НОРМ — практически здоровые доноры без клинических и лабораторных признаков инфекции (n=17, средний возраст — 11 лет); ВЭБинф — пациенты с ВЭБ-опосредованным ИМ (n=6, средний возраст — 12 лет); ВГЧ6инф — пациенты с ВГЧ6-опосредованным ИМ (n=7, средний возраст — 11 лет). Клинически здоровые добровольцы с лабораторными признаками инфекции, пациенты с ЦМВ-опосредованным ИМ или микст-инфекцией из исследования были исключены.

Забор материала. В качестве материала для исследования использовали образцы периферической крови. Забор крови у пациентов с инфекцией проводили до начала лечения, а также после выздоровления и исчезновения клинических и лабораторных признаков заболевания (группы ВЭБрек и ВГЧ6рек). Средний срок повторного забора крови составил 2 мес после реконвалесценции.

Исследование проведено в соответствии с Хель­синк­ской декларацией (2013) и одобрено Этическим комитетом Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора. Забор материала выполняли с информированного согласия родителей или опекунов пациентов.

Подготовка и гибридизация мРНК. Для выделения фракции лейкоцитов использовали раствор «Гемолитик» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Россия). С помощью набора «МАГНО-сорб» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Россия) из полученных лейкоцитов выделяли пул тотальной РНК, который дополнительно очищали и концентрировали смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Тотальная РНК (2 мкг) подвергалась обратной транскрипции и достройке второй цепи с применением набора Mint cDNA synthesis kit («Евроген», Россия), при этом 3’-олиго-Т-праймер заменяли на содержащий T7 промотор-олиго-Т-праймер («ДНК-синтез», Россия). Достройку второй цепи и амплификацию кДНК проводили в ходе 15 циклов ПЦР по программе: 95°С — 25 с; 60°С — 25 с; 72°С — 6 мин. Полученную двухцепочечную кДНК (2 мкг) транскрибировали с применением Т7 РНК-полимеразы (Thermo Scientific, Англия), добавляя биотиновую метку за счет использования биотинилированных нуклеотидов UTP («ДНК-синтез», Россия). Процедуру транскрипции повторяли трижды.

Полученные в результате синтеза пробы меченых РНК гибридизировали раздельно. Процедуру гибридизации РНК на биочип и считывание амперометрического сигнала выполняли с применением оборудования и реагентов ElectraSense (CustomArray Inc., США) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученный сигнал рассматривали как относительный уровень экспрессии гена или транскрипта.

Обработка данных. Обработку данных и расчеты выполняли с применением языка программирования R (версия 3.5.0; R Foundation for Statistical Computing, Австрия) и среды RStudio (версия 1.1.453; RStudio, США). Данные были нормализованы с использованием квантильной нормализации на основе негативного контроля [12]. Затем строили матрицу результатов, в которой строки соответствовали факторам — уровням экспрессии генов и их транскриптов, а колонки — пробам РНК, отнесенным к той или иной группе (НОРМ, ВЭБинф, ВГЧ6инф, ВЭБрек и ВГЧ6рек).

Далее проводили попарный дискриминантный анализ всех пяти групп. Строили модель зависимости принадлежности пробы РНК к одной из двух сравниваемых групп. Использовали алгоритм градиентного бустинга над решающими деревьями. Подбор параметров модели и оценку ее эффективности осуществляли с применением метода кросс-валидации. Полученный классификатор считали эффективным при значении медианы показателя аккуратности (accuracy) и медианы показателя площади (AUC) под кривой ошибок (area under receiver operating characteristic (ROC) curve) не менее 0,75. В случае построения эффективного классификатора для улучшения качества классификации проводили повторное моделирование, снижая количество факторов. Отбирали по 20 генов или транскриптов, обладающих максимальной важностью (feature importance) для каждой модели, полученной в результате кросс-валидации, исключая дублирование [10]. Далее отобранные показатели использовали для повторной процедуры моделирования, реализуемой аналогично первой.

На следующем этапе проводили сравнение уровня экспрессии каждого гена или транскрипта в группах НОРМ и ВЭБинф, НОРМ и ВГЧ6инф, ВЭБинф и ВГЧ6инф, НОРМ и ВЭБрек, НОРМ и ВГЧ6рек. Применяли Т-тест с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений (false discovery rate, FDR) с расчетом значений q. При q<0,05 различия в экспрессии генов и транскриптов считали статистически значимыми.

Также рассчитывали изменение уровня экспрессии. Для этого в каждой группе определяли среднее значение уровня экспрессии для каждого гена или транскрипта, после чего для каждой пары групп рассчитывали изменение экспрессии (%):

(среднее группы 2 · 100 / среднее группы 1) – 100.

На основании полученных данных о важности генов и транскриптов для повторной классификации, об изменении уровня их экспрессии и статистической значимости этого изменения делали выводы о возможности отнесения фактора к молекулярным маркерам ВЭБ-ИМ или ВГЧ6-ИМ. Среди факторов классификации пары НОРМ–ВЭБинф отбирали гены и транскрипты, удовлетворявшие следующим требованиям: уровень экспрессии маркера в группе ВЭБинф статистически значимо изменялся по сравнению с группой НОРМ; изменение уровня экспрессии маркера и/или его важность для классификации НОРМ–ВЭБинф превышала 75-й процентиль (пороговое значение установлено эмпирически) соответствующего показателя для всех факторов; маркер входил в состав факторов классификации ВГЧ6инф–ВЭБинф; маркер отсутствовал среди факторов классификации НОРМ–ВГЧ6инф. Отобранные гены или транскрипты считали маркерами ВЭБ-инфекции. Маркеры ВГЧ6-инфекции из факторов классификации НОРМ–ВГЧ6инф отбирали аналогично.

Результаты

На начальном этапе были построены модели классификации проб мРНК в группах сравнения НОРМ–ВЭБинф, НОРМ–ВГЧ6инф и ВГЧ6инф–ВЭБинф. При этом сокращение количества факторов позволило улучшить качество моделей при повторной классификации групп НОРМ–ВЭБинф и НОРМ–ВГЧ6инф. Для групп сравнения ВГЧ6инф–ВЭБинф снижение количества факторов и повторное моделирование улучшило качество классификации незначительно (табл. 1). В среднем количество факторов, используемых для второй классификации, составило менее 8% от исходного набора. Полный перечень генов и транскриптов, уровень которых учитывали при построении второй модели принадлежности проб РНК к группам НОРМ–ВЭБинф, НОРМ–ВГЧ6инф и ВГЧ6инф–ВЭБинф, представлен в дополнительных материалах (см. Приложения 2–4, https://drive.google.com/file/d/1xKS_MvENloPYKwuzeC1LaqFTH3i130So/view). Для групп сравнения ВЭБинф–ВЭБрек, ВГЧ6инф–ВГЧ6рек, НОРМ–ВЭБрек и НОРМ–ВГЧ6рек не удалось построить удовлетворительных моделей принадлежности проб РНК к группам (см. табл. 1).

---

Таблица 1. Характеристика моделей, построенных в ходе дискриминантного анализа проб РНК пациентов с инфекционным мононуклеозом и здоровых доноров

---

Далее согласно алгоритму были отобраны уникальные наборы молекулярных маркеров, позволяющих различить ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ (см. рисунок). Для каждого выявленного маркера проанализированы изменения уровня его экспрессии по сравнению с нормой в острую фазу заболевания и в период реконвалесценции (табл. 2). У пациентов с острым ВЭБ-ИМ наблюдалось снижение экспрессии транскриптов 5 AR и 4 ASCC1, мРНК FADD, а также гена CAD по сравнению с нормой. Экспрессия транскриптов 2 HLA-DPA1 и 4 RIPK1, наоборот, повышалась. Реконвалесценция сопровождалась нормализацией всех показателей, за исключением уровней экспрессии гена CAD и транскрипта 4 RIPK1, которые сохранялись измененными. У пациентов с ВГЧ6-ИМ вне зависимости от фазы заболевания экспрессия маркеров ВЭБ-ИМ соответствовала таковой у здоровых доноров. Исключение составила мРНК FADD, экспрессия которой у пациентов с ВГЧ6-ИМ возрастала.

---

Распределение генов и транскриптов относительно изменения экспрессии и важности для повторной классификации: а — классификация НОРМ–ВЭБинф; б — классификация НОРМ–ВГЧ6инф. Сплошными точками обозначены факторы, изменение экспрессии которых статистически значимо (q<0,05), перечеркнутыми — изменение экспрессии статистически не достоверно (q≥0,05). Пунктирной линией обозначен 75-й процентиль соответствующего показателя. Гены и транскрипты, определенные как специфичные молекулярные маркеры инфекции, подписаны справа от обозначающей точки. НОРМ — практически здоровые доноры; ВЭБинф — пациенты с острым ВЭБ-мононуклеозом; ВГЧ6инф — пациенты с острым ВГЧ6-мононуклеозом

---

Таблица 2. Изменение экспрессии генов и транскриптов в лейкоцитах крови пациентов в острую фазу инфекции и после выздоровления

---

В острый период ВГЧ6-ИМ обнаружено повышение экспрессии мРНК AVEN, транскриптов 2 CHUK, 2 CIRBP и 2 TRAF3, а также снижение экспрессии транскрипта 10 IRAK4. После выздоровления наблюдали нормализацию всех параметров за исключением уровня экспрессии транскрипта 2 TRAF3, который оставался повышенным. У пациентов с ВЭБ-ИМ экспрессия вышеперечисленных маркеров не изменялась, за исключением транскриптов 2 CIRBP и 10 IRAK4, уровни представленности которых соответственно снижались и повышались в острую фазу инфекции.

Обсуждение

Предложенный нами алгоритм обработки данных гибридизации проб РНК на ДНК-биочип позволяет выявить уникальный набор молекулярных маркеров ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ. Он основан на комбинации методов машинного обучения и традиционной статистики. Такой комбинированный подход позволил решить несколько задач: определить принципиальную возможность отнесения пациента к той или иной группе на основании экспрессии набора генов и индивидуальных транскриптов (задача классификации); сократить количество анализируемых факторов за счет удаления незначимых для анализа элементов (выделение важных для классификации параметров); определить статистически значимые изменения экспрессии каждого из множества генов у пациентов с ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ (задача статистики); выделить уникальный для каждого заболевания набор маркерных генов и транскриптов (логическое исключение).

В рамках настоящего исследования построены классификаторы, позволяющие дифференцировать практически здоровых лиц, пациентов с ВЭБ-ИМ и с ВГЧ6-ИМ на основании экспрессии изученных генов и транскриптов. Данный факт свидетельствует о существовании различий в молекулярных механизмах патогенеза двух вирусных инфекций. С другой стороны, модели отличий паттернов экспрессии генов и транскриптов группы пациентов после выздоровления от здоровых доноров и детей с острым ИМ построить не удалось. Полученный результат позволяет предположить, что экспрессия набора изученных нами генов и транскриптов после клинического выздоровления не нормализуется, по крайней мере в течение двух месяцев, сохраняя «молекулярный след» инфекции. Данный вывод подтверждается фактом изменения относительно нормы экспрессии некоторых маркеров ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ и после выздоровления (см. табл. 2). Таким образом, ВЭБ и ВГЧ6 способны оказывать пролонгированное влияние на иммунную систему пациента, регулируя экспрессию генов и транскриптов, участвующих в апоптозе, пролиферации и других фундаментальных процессах, которые реализуются в иммунокомпетентных клетках.

С использованием предложенного алгоритма нами определены уникальные наборы молекулярных маркеров ВЭБ- и ВГЧ6-ассоциированного мононуклеоза. Преобладающее большинство кандидатных маркеров являются сплайсированными вариантами мРНК генов, принадлежащих к разным функциональным группам. Часть транскриптов представляют собой единственный известный либо «основной» вариант мРНК одного гена (мРНК FADD, мРНК AVEN). Как правило, функция белков, кодируемых такими транскриптами, в литературе описывается как свойство самого гена. Другие транскрипты кодируют структурно-функциональные формы белка, отличные от «основного» варианта, но проявляющие схожие свойства (транскрипты 5 AR, 2 CHUK и 10 IRAK4). Третью группу формируют сплайсированные варианты мРНК гена, отличающиеся от «основной» формы нуклеотидными последовательностями в 5’-НТР (транскрипты 2 HLA-DPA1 и 4 RIPK1). Белковый продукт таких транскриптов аналогичен продукту «основного» сплайсированного варианта мРНК. При этом стабильность самих транскриптов и активность их трансляции могут отличаться вследствие различий нуклеотидного состава в регуляторных областях мРНК. Особый интерес представляют транскрипты, продукты трансляции которых имеют функцию, отличающуюся от таковой у «основного» варианта мРНК или прямо противоположную ему. Среди выявленных нами маркеров к этой группе относится транскрипт 4 ASCC1, кодирующий белок, который, в отличие от «основной» формы, не способен ингибировать экспрессию NF-kB и NF-kB-таргетных генов [13]. Другой пример — транскрипт 2 ингибитора NF-kB-киназ TRAF3, продукт которого индуцирует экспрессию NF-kB в активированных Т-клетках [14].

Помимо белок-кодирующих транскриптов в качестве маркера ВГЧ6-инфекции нами определен некодирующий транскрипт 2 регулятора клеточного цикла и индуктора апоптоза CIRBP. Функциональное значение не транслирующих белок транскриптов хорошо объяснено в рамках концепции непродуктивного сплайсинга — альтернативного сплайсинга, приводящего к образованию некодирующих транскриптов таргетного гена и их последующей деградации. Изменение соотношения кодирующих и некодирующих транскриптов определяет уровень экспрессии белкового продукта целевого гена [15]. Описанный механизм регуляции генной экспрессии за счет альтернативного сплайсинга может быть расширен и на кодирующие белок варианты мРНК: увеличение доли одного транскрипта приводит к уменьшению доли других транскриптов одного гена и наоборот.

Таким образом, использование транскриптов в качестве маркеров инфекционного заболевания не только оправдано, но и перспективно с точки зрения расширения диагностических и прогностических возможностей биомедицины. Некоторые транскрипты одного гена могут иметь различную клиническую информативность. Так, по нашим данным, снижение экспрессии транскрипта 4 ASCC1 специфично только для ВЭБ-ИМ, в то время как изменение экспрессии транскрипта 1 ASCC1 обнаружено как при ВЭБ-ИМ, так и при ВГЧ6-ИМ (см. Приложения 2, 3, https://drive.google.com/file/d/1xKS_MvENloPYKwuzeC1LaqFTH3i130So/view). При этом большинство используемых в настоящее время диагностических тест-систем определяют экспрессию гена или содержание белка, но не позволяют оценивать соотношение индивидуальных транскриптов.

Полученные нами результаты говорят об активации различных молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза клеток в лейкоцитах крови пациентов с ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ. Развитие ВЭБ-инфекции сопровождалось снижением экспрессии промоторов пролиферации транскрипта 5 рецептора стероидных гормонов AR, транскрипта 4 ASCC1 и гена CAD. С другой стороны, при ВЭБ-ИМ также наблюдалось снижение экспрессии мРНК адаптерной молекулы FADD, играющей ключевую роль в цитотоксическом иммунном ответе и апоптозе, и повышение экспрессии транскрипта 4 RIPK1. Киназа RIPK1 является полифункциональным белком, входящим в состав сигнальных путей некроптоза, воспаления и активации NF-kB. Интересно отметить, что реализация некроптоза требует формирования крупного сигнального комплекса, в состав которого в эквимолярных количествах входят RIPK1, FADD, каспаза-8 и другие белки [16]. Таким образом, выявленное усиление экспрессии транскрипта 4 RIPK1 при ВЭБ-инфекции на фоне снижения экспрессии FADD может ингибировать апоптоз клетки и способствовать ее выживанию и пролиферации. Кроме того, обнаружено повышение экспрессии транскрипта 2 HLA-DPA1, который не только играет важную роль в презентации антигена, но и служит корецептором, облегчая проникновение ВЭБ в В-лимфоциты [17].

Функциональная роль маркеров ВГЧ6-инфекции преимущественно сводится к активации транскрипции и подавлению апоптоза в клетках. Так, обнаружено повышение экспрессии активаторов NF-kB транскрипта 2 TRAF3 и транскрипта 2 CHUK на фоне роста уровня экспрессии мРНК ингибитора митохондриального пути апоптоза AVEN. Экспрессия некодирующего транскрипта 2 проапоптотического фактора CIRBP повышалась, что также свидетельствует о снижении апоптотической активности в клетках. Кроме того, отметим снижение экспрессии важного медиатора врожденного иммунного ответа транскрипта 10 IRAK4.

Выявленные уникальные наборы молекулярных маркеров ВЭБ- и ВГЧ6-инфекционного мононуклеоза могут быть использованы в качестве терапевтических мишеней при разработке средств современной биотерапии. Важно отметить, что предложенный нами алгоритм может применяться для поиска уникальных маркеров патогенеза других инфекционных заболеваний.

Заключение

В лейкоцитах крови детей и подростков с ВЭБ и ВГЧ6, ассоциированными с мононуклеозом, выявлено изменение экспрессии некоторых генов и транскриптов, регулирующих активацию, пролиферацию и апоптоз иммунокомпетентных клеток. По сравнению с нормой в лейкоцитах пациентов с ВЭБ-инфекцией выявлено снижение экспрессии транскриптов 5 AR и 4 ASCC1, гена CAD и мРНК FADD на фоне повышения экспрессии транскриптов 2 HLA-DPA1 и 4 RIPK1. У пациентов с ВГЧ6-ИМ обнаружено повышение экспрессии мРНК AVEN, транскриптов 2 CHUK, 2 CIRBP и 2 TRAF3, а также снижение экспрессии транскрипта 10 IRAK4. Выявленные маркеры являются важными участниками патогенеза ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ и отражают специфические черты его молекулярных механизмов, а также иммунного ответа на инфекцию. Наборы выявленных маркеров уникальны для двух исследованных инфекций.

Финансирование исследования. Работа выпол­нена по государственному заданию №АААА-А16-116040810135-4.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.