Комплекс методик на основе пиросеквенирования для определения соматических мутаций в кодонах 600 и 601 гена BRAF

Цель исследования — разработка методик для дифференцировки мутаций в кодоне 600 гена BRAF и повышения чувствительности определения мутации К601Е.

Материалы и методы. Нуклеотидную последовательность кодонов 592–602 гена BRAF определяли с помощью системы генетического анализа PyroMark Q24. Для поиска мутаций в кодоне 600 использовали праймер 600-S с порядком добавления нуклеотидов GCTGTCАTCTGCTAGCTAGAC (соответствует нуклеотидам 1799–1786). Для определения мутации K601E применяли праймер 601-S с порядком добавления нуклеотидов GCTACTCACTGTAG (соответствует нуклеотидам 1801–1793). Аналитические характеристики предлагаемых методик для выявления соматических мутаций определяли на разведениях образцов плазмидной ДНК, включающих участок гена BRAF без мутаций или с одной из мутаций: V600E, V600R, V600K, V600M, K601Е. Апробацию проводили на 132 образцах биологического материала, полученных из узловых образований щитовидной железы.

Результаты. С помощью разработанных методик в образцах с высокой концентрацией ДНК можно определять 2% мутации V600E или V600M, 1% — V600K и V600R, 3% — K601E; в образцах с низкой концентрацией (менее 500 копий/ПЦР) — уверенно выявлять от 5% мутантного аллеля для всех мутаций. При тестировании биологического материала обнаружено 53 образца с мутацией V600E, доля мутантного аллеля составляла 4,9–50,0%.

Заключение. Разработаны комплекс методик для определения нуклеотидной последовательности кодонов 592–601 гена BRAF и алгоритм тестирования образцов и анализа мутаций в кодонах 600–601 гена BRAF. Методика обеспечивает достаточную чувствительность для выявления частых мутаций в кодонах 600 и 601 и позволяет однозначно их дифференцировать.

1. Pisapia P., Pepe F., Iaccarino A., Sgariglia R., Nacchio M., Russo G., Gragnano G., Malapelle U., Troncone G. BRAF: a two-faced Janus. Cells 2020; 9(12): 2549, https://doi.org/10.3390/cells9122549.
2. Frisone D., Friedlaender A., Malapelle U., Banna G., Addeo A. A BRAF new world. Crit Rev Oncol Hematol 2020; 152: 103008, https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2020.103008.
3. Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., Sondka Z., Beare D.M., Bindal N., Boutselakis H., Cole C.G., Creatore C., Dawson E., Fish P., Harsha B., Hathaway C., Jupe S.C., Kok C.Y., Noble K., Ponting L., Ramshaw C.C., Rye C.E., Speedy H.E., Stefancsik R., Thompson S.L., Wang S., Ward S., Campbell P.J., Forbes S.A. COSMIC: the catalogue of somatic mutations in cancer. Nucleic Acids Res 2019; 47(D1): D941–D947, https://doi.org/10.1093/nar/gky1015.
4. Dankner M., Rose A.A.N., Rajkumar S., Siegel P.M., Watson I.R. Classifying BRAF alterations in cancer: new rational therapeutic strategies for actionable mutations. Oncogene 2018; 37(24): 3183–3199, https://doi.org/10.1038/s41388-018-0171-x.
5. Zaman A., Wu W., Bivona T.G. Targeting oncogenic BRAF: past, present, and future. Cancers (Basel) 2019; 11(8): 1197, https://doi.org/10.3390/cancers11081197.
6. Ducreux M., Chamseddine A., Laurent-Puig P., Smolenschi C., Hollebecque A., Dartigues P., Samallin E., Boige V., Malka D., Gelli M. Molecular targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer. Ther Adv Med Oncol 2019; 11: 1758835919856494, https://doi.org/10.1177/1758835919856494.
7. Bracht J.W.P., Karachaliou N., Bivona T., Lanman R.B., Faull I., Nagy R.J., Drozdowskyj A., Berenguer J., Fernandez-Bruno M., Molina-Vila M.A., Rosell R. BRAF mutations classes I, II, and III in NSCLC patients included in the SLLIP trial: the need for a new pre-clinical treatment rationale. Cancers (Basel) 2019; 11(9): 1381, https://doi.org/10.3390/cancers11091381.
8. Patel K.N., Yip L., Lubitz C.C., Grubbs E.G., Miller B.S., Shen W., Angelos P., Chen H., Doherty G.M., Fahey T.J. III, Kebebew E., Livolsi V.A., Perrier N.D., Sipos J.A., Sosa J.A., Steward D., Tufano R.P., McHenry C.R., Carty S.E. The American Association of Endocrine Surgeons guidelines for the definitive surgical management of thyroid disease in adults. Ann Surg 2020; 271(3): e21–e93, https://doi.org/10.1097/sla.0000000000003580.
9. Али С.З., Сибас Э.С. Классификация Бетесда для цитологической диагностики заболеваний щитовидной железы: терминология, критерии и пояснения. Пер. с англ. Шапиро Н.А. М: Практическая медицина; 2020; 240 с.
10. Бельцевич Д.Г., Мудунов А.М., Ванушко В.Э., Ру­мян­­цев П.О., Мельниченко Г.А., Кузнецов Н.С., Подвяз­ни­ков С.О., Алымов Ю.В., Поляков А.П., Фадеев В.В., Бо­ло­тин М.В., Севрюков Ф.Е., Крылов В.В., Феденко А.А., Бо­лотина Л.В., Жаров А.А., Фалалеева Н.А., Фило­нен­­ко Е.В., Невольских А.А., Иванов С.А., Хайло­ва Ж.В., Ге­вор­кян Т.Г. Клинические рекомендации. Диффе­ренци­рованный рак щитовидной железы. Министерство здравоохранения Российской Федерации; 2020; 47 c. URL: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/329_1.
11. Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C., Doherty G.M., Mandel S.J., Nikiforov Y.E., Pacini F., Randolph G.W., Sawka A.M., Schlumberger M., Schuff K.G., Sherman S.I., Sosa J.A., Steward D.L., Tuttle R.M., Wartofsky L. 2015 American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: the American Thyroid Association guidelines task force on thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid 2016; 26(1): 1–133, https://doi.org/10.1089/thy.2015.0020.
12. Malapelle U., Rossi G., Pisapia P., Barberis M., Buttitta F., Castiglione F., Cecere F.L., Grimaldi A.M., Iaccarino A., Marchetti A., Massi D., Medicina D., Mele F., Minari R., Orlando E., Pagni F., Palmieri G., Righi L., Russo A., Tommasi S., Vermi W., Troncone G. BRAF as a positive predictive biomarker: focus on lung cancer and melanoma patients. Crit Rev Oncol Hematol 2020; 156: 103118, https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2020.103118.
13. Cardus B., Colling R., Hamblin A., Soilleux E. Comparison of Methodologies for the detection of BRAF mutations in bone marrow trephine specimens. J Clin Pathol 2019; 72(6): 406–411, https://doi.org/10.1136/jclinpath-2019-205734.
14. Cheng L., Lopez-Beltran A., Massari F., MacLennan G.T., Montironi R. Molecular testing for BRAF mutations to inform melanoma treatment decisions: a move toward precision medicine. Mod Pathol 2018; 31(1): 24–38, https://doi.org/10.1038/modpathol.2017.104.
15. Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Субботина Т.Н., Башмакова Е.Е., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика 2014; 59(11): 60–63.
16. Дрибноходова О.П., Дунаева Е.А., Лешкина Г.В., Яры­гина Е.А., Бухарина А.Ю., Войцеховская Я.А., Бори­сова Э.В., Бормотова С.К., Дауд А.И., Хлявич В.Н., Миро­нов К.О. Выявление соматических мутаций в гене BRAF методом пиросеквенирования. Сибирский онкологический журнал 2021; 20(5): 75–83, https://doi.org/10.21294/1814-4861-2021-20-5-75-83.
17. Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Спра­вочник заведующего КДЛ 2016; 5: 33–43.
18. Дрибноходова О.П., Миронов К.О., Дунаева Е.А., Де­­мидова И.А., Баринов А.А., Войцеховская Я.А., Мар­ке­лов М.Л., Шипулин Г.А. Выявление активирующих соматических мутаций в гене KRAS методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика 2013; 6: 49–51.
19. Дунаева Е.А., Миронов К.О., Субботина Т.Н., Оль­хов­ский И.А., Шипулин Г.А. Разработка и сравнительная апробация методик для повышения чувствительности определения мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика 2017; 62(2): 125–128.
20. Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev 2008; 29(Suppl 1): S49–S52.
21. Ihle M.A., Fassunke J., König K., Grünewald I., Schlaak M., Kreuzberg N., Tietze L., Schildhaus H.U., Büttner R., Merkelbach-Bruse S. Comparison of high resolution melting analysis, pyrosequencing, next generation sequencing and immunohistochemistry to conventional Sanger sequencing for the detection of p.V600E and non-p.V600E BRAF mutations. BMC Cancer 2014; 14: 13, https://doi.org/10.1186/1471-2407-14-13.

Dribnokhodova O.P., Esman A.S., Korchagin V.I., Bukharina A.Yu., Dunaeva E.A., Leshkina G.V., Borisova E.V., Voiciehovskaya Ya.A., Daoud A.I., Khlyavich V.N., Mironov K.O. A Complex of Pyrosequencing-Based Methods for Detection of Somatic Mutations in Codons 600 and 601 of the BRAF Gene. Sovremennye tehnologii v medicine 2022; 14(2): 41, https://doi.org/10.17691/stm2022.14.2.04