Том 18, номер 3 (2026)

Регуляция аскорбиновой кислотой и радикалами НОО• формирования внеклеточных ДНК-сетей и интернализационной активности мононуклеарных клеток

К.М. Фиайос Баррионуэво, Д. Саного, Е.Н. Горшкова, И.П. Иванова

---

2026, Том 18, номер 3, стр. 47 Назад

Введение

Аскорбиновая кислота является типичным модулятором окислительно-восстановительных процессов, а также признанным антиоксидантом, который непосредственно нейтрализует активные формы кислорода (АФК), защищает другие антиоксидантные системы и участвует в механизмах клеточной регенерации [1]. Молекула аскорбиновой кислоты имеет ендиольную группировку, что обусловливает протекание сложных окислительно-восстановительных процессов и образование промежуточных продуктов, таких как дегидроаскорбиновая кислота. Однако действие аскорбиновой кислоты имеет концентрационно-зависимый характер. В присутствии свободных металлов переходной валентности и при высоких фармакологических концентрациях аскорбиновая кислота может действовать как прооксидант, проявляя цитотоксичность [2].

Известно, что АФК (пероксидный, супероксидный, гидроксильный радикалы, пероксид водорода и др.) являются прооксидантами и активируют свободнорадикальные процессы. Однако АФК способны к рекомбинации (блокируют цепи радикальных реакций) и как сигнальные молекулы участвуют в процессах деления клеток, апоптозе и др. [3]. Концентрация АФК возрастает в процессе интернализации частиц иммунными клетками. В фагоцитирующей клетке происходят разобщение дыхательных цепей, деполяризация внутренней митохондриальной мембраны, изменение баланса НАДН/НАД+ и ФАД+ [4]. Эти процессы также являются ключевыми событиями, необходимыми для активации деконденсации хроматина и высвобождения внеклеточной ДНК [5].

Таким образом, интернализационная активность и формирование ДНК-сетей регулируются работой НАДН-оксидаз и окислительно-восстановительными процессами. Следовательно, агенты, усиливающие или ингибирующие реакции окисления или восстановления — прооксиданты и антиоксиданты, приобретают биотехнологическое значение как регуляторы работы иммунной системы.

Мононуклеарные клетки — лимфоциты, моноциты, макрофаги, натуральные киллеры и дендритные клетки — представляют собой гетерогенную группу лейкоцитов иммунной системы, характеризующихся одним несегментированным ядром. Эти клетки выполняют разнообразные специализированные функции в иммунной системе, включая поддержание гомеостаза, резистентность к микроорганизмам, участие в воспалительных процессах, регенерации тканей и др. [6]. Использование в скрининговых in vitro исследованиях суспензий, включающих популяции различных мононуклеарных и других клеток, более точно отражает сложность микросреды in vivo, чем использование отдельных клеточных линий или очищенных субпопуляций.

Основными функциями макрофагов и моноцитов являются фагоцитоз (тип эндоцитоза), процессинг антигенов, а также презентация антигенных детерминант хелперным и цитотоксическим Т-лимфоцитам. Т-хелперы выполняют центральную роль в передаче информации о структуре антигена В-лимфоцитам, а В-лимфоциты трансформируются в клетки, продуцирующие антитела к антигену. Натуральные киллеры распознают и уничтожают клетки, которые утратили способность экспрессировать молекулы главного комплекса гистосовместимости первого класса [6].

При высокой концентрации во внутренней среде организма патогенов, крупных или мелких частиц клеточного дебриса иммунные клетки (в основном нейтрофилы) могут активировать формирование внеклеточных ДНК-сетей как альтернативный защитный механизм. ДНК-сети или ДНК-ловушки — это ретикулярные структуры деконденсированного хроматина, которые содержат гистоны и ферменты с антимикробными свойствами, способные связываться с дебрисом клеток или патогенами и уничтожать их [5]. Деконденсация хроматина и формирование внеклеточных ДНК-сетей запускаются клеткой, когда эндоцитоз и фагоцитоз невозможны или недостаточно эффективны.

Процессы интернализации частиц и формирования внеклеточных ДНК-сетей — это два взаимосвязанных механизма врожденного иммунитета, которые обеспечивают эффективную защиту организма. Оба процесса активируются схожими сигналами, дополняют друг друга и обеспечивают многоуровневую защиту от патогенов. Одной из причин снижения эффективной работы иммунной системы может быть процесс интенсивного формирования внеклеточных ДНК-сетей иммунными клетками, который часто ассоциируется с различными патологиями, а также химическими и физическими воздействиями.

Традиционно формирование внеклеточных ДНК-сетей описывалось как механизм защиты от патогенов, присущий исключительно нейтрофилам, — процесс нетоза [5]. Недавние научные исследования доказывают, что другие клетки иммунной системы, включая моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки и лимфоциты, также обладают способностью генерировать внеклеточные ДНК-сети в ответ на различные стимулы [7–9].

В контексте настоящего исследования особенно важно отметить, что информации о формировании внеклеточных ДНК-сетей Т- и В-лимфоцитами очень мало, а регуляция образования ДНК-сетей практически не изучена. Однако эти клетки являются центральными компонентами мононуклеарной фракции крови и селезенки, играют ключевую роль как во врожденном, так и в адаптивном иммунном ответе.

Чрезмерное или нерегулируемое образование внеклеточных ДНК-сетей лейкоцитами способствует хроническому воспалению, повреждению тканей (включая тромбоз и активацию свободнорадикальных процессов) и в некоторых случаях — прогрессированию опухолей [7, 8].

Для физиологического функционирования иммунных клеток и для поддержания гомеостаза организма имеет значение окислительно-восстановительное равновесие [10]. Образование внеклеточных ДНК-сетей и эндоцитоз являются физиологическими реакциями, которые тонко регулируются окислительно-восстановительным контекстом микроокружения [11].

До настоящего времени не изучены концентрации прооксидантов и антиоксидантов (экзогенных или эндогенных), модулирующих выбор клетки между программами интернализации частиц и образованием внеклеточных ДНК-сетей. Кроме того, крайне важно определить факторы и условия, при которых возможно направленное регулирование активности мононуклеарных клеток.

Цель исследования — выявить регуляторный потенциал аскорбиновой кислоты и радикалов НОО• в процессах формирования внеклеточных ДНК-сетей и интернализационной активности мононуклеарных клеток крови и селезенки крыс.

Материалы и методы

Исследование проведено in vitro на мононуклеарных клетках, выделенных из крови и селезенки шести лабораторных беспородных крыс массой тела 200–250 г в возрасте 6–10 мес. Условия содержания соответствовали стандартным требованиям вивария.

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с этическими нормами приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации «Об утверждении Правил лабораторной практики» №708-н от 23.08.2010 г. и с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986 г.). Исследования обсуждены и одобрены комиссией по биоэтике Нижегородского государственного исследовательского университета им. Н.И. Лобачевского (протокол №95 от 28 февраля 2025 г.).

Перед сбором биологического материала крысам внутрибрюшинно вводили 100 мкл гепарина в качестве антикоагулянта, после чего проводили анестезию Золетилом 100 (50 мг/кг).

Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Рис. 1. Схема эксперимента

Выделение мононуклеарных клеток из крови

Кровь (8–10 мл) собирали в пробирки, содержащие гепарин в качестве антикоагулянта. Выделение мононуклеарных клеток проводили методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколла. Кровь разбавляли в соотношении 1:1 стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) без ионов Ca²⁺/Mg²⁺ при комнатной температуре. В пробирку объемом 10 мл добавляли 4 мл фиколла (1,077 г/мл; Ficoll-Paque®, Россия), а затем — 8 мл разбавленной крови (1:2), которую аккуратно наслаивали, поддерживая прозрачную границу раздела двух фаз (не смешивали). Пробирки центрифугировали при 3000 об./мин (1750 g) в течение 30 мин при комнатной температуре. После центрифугирования образовывались 4 отчетливых слоя: 1) верхний слой — плазма; 2) средний слой — беловатый (кольцо мононуклеарных клеток); 3) нижний слой — фиколл и 4) осадок — эритроциты и гранулоциты.

Средний слой мононуклеарных клеток аккуратно отбирали и переносили в пробирку. Собранные клетки дважды промывали холодным (4°C) стерильным фосфатно-солевым буфером при 1500 об./мин (875 g) в течение 10 мин, тщательно удаляя надосадочную жидкость после каждого центрифугирования. Для удаления остаточных эритроцитов осадок ресуспендировали в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0,1 мМ Na₂EDTA, pH=7,4) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мл фосфатно-солевого буфера, смесь центрифугировали при 1500 об./мин (875 g) в течение 5 мин и надосадочную жидкость удаляли. Осадок мононуклеарных клеток ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере и доводили концентрацию до 2,0±0,5·10⁶ кл./мл.

Выделение мононуклеарных клеток из гомогената селезенки

Селезенку удаляли в стерильных условиях и механически гомогенизировали. Суспензию промывали фосфатно-буферным раствором (pH=7,4) для удаления крупных фрагментов ткани. Мононуклеарные клетки выделяли по протоколу, описанному выше для крови: центрифугирование в градиенте фиколла (1750 g, 30 мин, 20–22°C) с последующим двукратным промыванием фосфатно-буферным раствором, и доводили концентрацию до 2,0±0,5·10⁶ кл./мл. Выделение мононуклеарных клеток селезенки в градиенте фиколла позволяет удалить нейтрофилы, которые составляют приблизительно 15% в ткани селезенки.

Фракция мононуклеарных клеток представляет по своей природе гетерогенную популяцию, включающую Т-лимфоциты (CD4⁺/CD8⁺ и др.), В-лимфоциты (CD45R⁺), естественные киллеры (NK; CD161a⁺) и моноциты (CD68⁺/CD14⁺). В целом в мононуклеарной фракции лимфоциты составляют от 70 до 90% от общего числа клеток, моноциты — от 10 до 20%, NK-клетки — от 5 до 15%, а дендритные клетки немногочисленны, их всего от 1 до 2%.

Гетерогенная фракция выбрана в качестве начального и необходимого шага для характеристики общей реакции гетерогенной популяции на воздействие свободных радикалов, аскорбиновой кислоты и их комбинированного действия. Следует признать, что присущая мононуклеарной фракции гетерогенность исключает возможность изучения каждой субпопуляции клеток в изоляции на этом начальном этапе. Однако анализ суммарных эффектов суспензий с различными иммунными клетками более точно моделирует микроокружение, в котором находятся иммунные клетки in vivo, в отличие от гомогенных субпопуляций.

Сразу после выделения мононуклеарных клеток их подвергали воздействию аскорбиновой кислотой и радикалами HOO• в различных концентрациях.

Аскорбиновую кислоту (производитель Sigma-Aldrich, США) применяли в концентрациях 10 и 50 мкМ. В контрольную серию клеток добавляли эквивалентный объем фосфатно-солевого буфера.

Гидропероксильные радикалы получали в процессе генерации излучения газоразрядной плазмы искрового разряда с использованием экспериментального оборудования ИР-50 (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва). Импульсный искровой разряд в воздухе генерировался с частотой ~50 Гц; излучение плазмы искрового разряда представляет собой источник свободных радикалов, в первую очередь HOO• [12].

Концентрацию радикалов HOO• в водной среде рассчитывали на основе скорости генерации радикалов генератором: (8,0±0,1)·10^–5 моль/(л·мин) [13]. Время работы генератора искрового плазменного разряда для разных доз радикалов HOO• в нашем исследовании составило 0,5; 2,5 и 7,5 мин. Соответственно концентрации радикалов HOO• — 40, 200 и 600 мкМ.

Для оценки комбинированного воздействия клетки инкубировали с аскорбиновой кислотой в течение 15 мин при комнатной температуре перед воздействием свободных радикалов.

Эксперимент проводили следующим образом.

Оценка влияния аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• на мембранотоксичность (жизнеспособность) клеток. Для оценки мембранотоксического действия различных концентраций аскорбиновой кислоты и радикалов HOO•, а также их комбинаций проведен анализ целостности плазматической мембраны (жизнеспособности). Клетки изучали после инкубации с прижизненным красителем трипановым синим [14]. Принцип метода состоит в том, что в жизнеспособные клетки с неповрежденными мембранами краситель не проникает. Нежизнеспособные клетки имеют повреждения в мембране, поэтому краситель проникает в цитоплазму клетки и окрашивает ее в синий цвет.

Сразу после обработки клеточные суспензии смешивали в соотношении 1:1 с 0,4% раствором трипанового синего в стерильном фосфатно-буферном растворе. Смесь инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре, затем помещали в камеру для подсчета количества клеток (камера Горяева) с целью микроскопического наблюдения (об. 40×) под микроскоп «Биомед-4» («БИОМЕД», Россия). Подсчитывали 100 клеток на образец, различая окрашенные (синие, с поврежденными мембранами) и неокрашенные (светлые, с неповрежденными мембранами) клетки. Результаты выражали в процентах клеток с поврежденными мембранами относительно общего числа подсчитанных клеток.

Были использованы изолированные мононуклеарные клетки от 6 животных; каждая экспериментальная серия проведена в 3 повторностях (всего проанализировано 1800 клеток).

Изучение активности интернализации частиц (эндоцитоз) клетками. Эндоцитоз используется для оценки способности интернализации латексных частиц мононуклеарными клетками. Моноциты и макрофаги интернализируют частицы преимущественно путем фагоцитоза; другие популяции мононуклеарных клеток (такие как Т-клетки и NK) и другие субпопуляции могут использовать альтернативные механизмы эндоцитоза (такие как рецептор-опосредованный эндоцитоз или макропиноцитоз). Гетерогенная фракция мононуклеарных клеток, проанализированная в этом исследовании, включает в основном Т- и В-лимфоциты, NK, моноциты и макрофаги. Все эти клетки обладают различными эндоцитарными механизмами. Таким образом, способность интернализации частиц латекса является наиболее точным индикатором процесса эндоцитоза.

Эндоцитарную способность мононуклеарных клеток оценивали in vitro путем инкубации со стандартизированными латексными частицами.

В каждую пробирку, содержащую суспензию клеток (приблизительно 2·10⁶ клеток), добавляли 50 мкл суспензии латексных частиц. Коммерческий препарат частиц латекса с диаметром 1,5 мкм («ДИАМ», Россия) предварительно разбавляли в стерильном фосфатно-солевом буфере (pH=7,4) в соотношении 1:100, чтобы избежать неспецифического насыщения. Смесь клеток и латекса инкубировали в течение 60 мин при 37°C в атмосфере 5% CO₂, обеспечивая осаждение и контакт клеток с частицами для активной интернализации.

После инкубации клетки осторожно центрифугировали при 1500 об./мин (875 g) в течение 5 мин для удаления любых неинтернализованных частиц, оставшихся в супернатанте. Тонкие клеточные мазки готовили на обезжиренных предметных стеклах и давали высохнуть на воздухе при комнатной температуре. Затем препараты фиксировали, погружая предметные стекла в 96% абсолютный этанол на 20 мин.

Дифференциальное окрашивание проводили по методу Романовского в соответствии с инструкциями производителя. Эта методика окрашивания позволяет четко дифференцировать морфологию клеток (ядро, цитоплазма) от контура латексных частиц.

Анализ проводили с использованием оптического микроскопа Olympus U-RFL-T (Olympus, Япония) с объективом 100×. Исследовали 100 мононуклеарных клеток на образец, распределенных как минимум по пяти различным микроскопическим полям зрения, для обеспечения репрезентативности.

Эндоцитоз-активными клетками считали клетки, содержащие одну или более внутриклеточных латексных частиц (идентифицированных по их сферической морфологии).

Для характеристики эндоцитарного ответа определяли два основных параметра:

эндоцитарную активность — процент активных клеток, рассчитываемый как количество клеток, которые поглотили хотя бы одну латексную частицу, деленное на общее количество подсчитанных клеток, умноженное на 100;

эндоцитарный индекс (способность к поглощению) — эффективность захвата частиц активными клетками. Он рассчитывался путем суммирования общего числа поглощенных клетками частиц латекса, подсчитанных во всех эндоцитоз-активных клетках, и деления этого значения на общее число эндоцитоз-активных клеток.

Исследование концентрации внутриклеточных АФК. Внутриклеточное образование АФК во время эндоцитоза отслеживали в режиме реального времени с помощью флуоресцентного зонда дигидрородамина 123 (DHR123). Этот нефлуоресцентный зонд проникает в клетки и при окислении АФК превращается в родамин 123 — высокофлуоресцентный флуорофор, интенсивность которого пропорциональна внутриклеточной концентрации АФК. Анализ имеет решающее значение для понимания того, модулируют ли аскорбиновая кислота и радикал HOO• способность к внутриклеточной генерации АФК во время эндоцитоза.

Внутриклеточную концентрацию АФК в мононуклеарных клетках крови анализировали в течение 1 ч (интервал записи 30 мин) на проточном цитометре CytoFLEX (Beckman Coulter, США). Для этого к 50 мкл суспензии мононуклеарных клеток добавляли 500 мкл флуоресцентного красителя дигидрородамина 123 (1 мкМ/мл), инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Возбуждение флуоресценции осуществляли с помощью синего лазера (488 нм), излучение регистрировали на длинах волн 525/40 нм. В процессе работы в каждой серии цитометр анализировал флуоресценцию 50 000 клеток.

Анализ формирования внеклеточных ДНК-сетей. Мы поставили перед собой задачу оценить процесс формирования внеклеточных ДНК-сетей в гетерогенной фракции мононуклеарных клеток крови и селезенки крыс, подвергнутых воздействию радикалов HOO• и аскорбиновой кислоты, так как образование внеклеточных ДНК-сетей этими клетками снижает функциональную активность всей популяции мононуклеарных клеток.

Формирование внеклеточных ДНК-сетей наблюдали сразу и через 60 мин после обработки клеток изучаемыми факторами и инкубации при 37°. Далее готовили мазки и окрашивали по Романовскому–Гимзе (ЗАО «ЭКОлаб», Россия). Окрашивание по Романовскому–Гимзе является стандартным методом визуализации ядерных структур и внеклеточных ДНК-сетей, поскольку позволяет четко дифференцировать деконденсированный хроматин, выходящий за пределы клеточной мембраны, на фоне остальных клеточных компонентов благодаря метахроматическому окрашиванию нуклеиновых кислот в фиолетово-синих оттенках.

Определение окислительной модификации белков клеток по уровню флуоресценции гликированых белков и триптофана. Для оценки влияния аскорбиновой кислоты и радикала HOO• на молекулярную целостность клеточных белков была изучена собственная флуоресценция аминокислоты триптофана и гликозилированных белков.

Снижение флуоресценции триптофана указывает на молекулярную денатурацию аминокислоты, которая изменяет структуру и функцию белка. Количественная оценка гликозилированных белков (конечных продуктов гликирования, AGEs) позволяет определить интенсивность неферментативных реакций гликирования и окислительной модификации белков.

Флуоресценцию аминокислоты триптофана регистрировали через 1 мин и через 60 мин после начала эндоцитоза на флуориметре «Флюорат-02-Панорама» (ООО «Люмэкс», Россия) при возбуждении 288 нм, эмиссии 350 нм; флуоресценцию гликированных белков — при возбуждении 380 нм, эмиссии 490 нм.

Анализ окислительно-восстановительного баланса клеток (уровень НАД+ и НАДН). Для оценки окислительно-восстановительного баланса клеток исследовали спектры поглощения кофермента НАД+ (окисленная форма) и НАДН (восстановленная форма) через 1 мин и через 60 мин после начала эндоцитоза на спектрофлуориметре «Флюорат-02-Панорама» (ООО «Люмэкс», Россия). Изучали спектры поглощения НАД (λ=260 нм) и НАДН (λ=360 нм). Эти параметры отражают как баланс окислительно-восстановительных процессов в клетке, так и метаболическую активность.

В связи с масштабом исследования и количеством необходимых определений эксперименты были разделены между мононуклеарными клетками, выделенными из крови и селезенки. Выход клеток, полученный из крови и селезенки, был достаточен для проведения всех запланированных анализов, но недостаточен для одновременного воспроизведения всего эксперимента.

С целью оптимизации экспериментальных ресурсов были проведены предварительные сравнительные анализы для установления реакции обеих популяций клеток по интересующим параметрам. Результаты этих предварительных исследований не показали существенных различий между клетками крови и селезенки по оцениваемым показателям.

На суспензиях мононуклеарных клеток селезенки изучены мембранотоксический эффект аскорбиновой кислоты и радикалов HOO•, эндоцитарная активность (интернализация частиц) и формирование внеклеточных ДНК-сетей. На суспензиях мононуклеарных клеток крови исследованы эндоцитарная активность (интернализация частиц), генерация внутриклеточных АФК, формирование внеклеточных ДНК-сетей, окислительная модификация белков (уровень гликированных белков и триптофана), окислительно-восстановительный баланс клеток (уровень НАД+ и НАДН).

Статистическая обработка данных

Мы провели эксперименты in vitro на мононуклеарных клетках шести животных, каждый эксперимент был выполнен в трех повторностях.

Обработку и анализ данных проводили с использованием программного обеспечения SPSS 25 Statistics (IBM, США). Первоначально с помощью теста Шапиро–Уилка оценивали нормальность распределения данных.

Для анализа внутриклеточной концентрации АФК в мононуклеарных клетках периферической крови, определяемых методом проточной цитометрии, применяли однофакторный параметрический дисперсионный анализ (ANOVA). Этот метод был выбран из-за большого количества событий, анализируемых проточным цитометром (50 000 клеток на образец). Результаты представлены как M±SD, где M — среднее арифметическое, а SD — стандартное отклонение среднего. Для апостериорных множественных сравнений использовали тест Тьюки.

Для экспериментов, где данные не соответствовали нормальному распределению, применяли непараметрические методы. Сравнения между группами проводили с использованием теста Краскела–Уоллиса, при этом значения p<0,05 считали статистически значимыми. Уровни значимости были скорректированы с использованием поправки Бонферрони.

Данные непараметрического анализа представлены на диаграммах размаха в виде медианы (внутренняя линия), межквартильного размаха (IQR), а также минимального и максимального значений.

Результаты

Оценка влияния аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• на мембранотоксичность (жизнеспособность) клеток. Результаты исследования мембранотоксического эффекта различных концентраций аскорбиновой кислоты и радикала HOO•, а также их сочетанного действия выявили концентрационно-зависимое повреждение мембран мононуклеарных клеток как радикалами HOO•, так и аскорбиновой кислотой в высоких концентрациях.

Высокая концентрация радикалов HOO• вызывала повреждение мембран у 56% мононуклеарных клеток, а высокая концентрация аскорбиновой кислоты — у 30% (рис. 2).

Рис. 2. Количество мононуклеарных клеток с неповрежденными мембранами после инкубации с аскорбиновой кислотой, воздействия радикалами HOO• и комплексного воздействия радикалами HOO• и аскорбиновой кислотой. * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с серией после воздействия только радикалами HOO• в концентрации 600 мкМ (р<0,05)

Предварительная инкубация мононуклеарных клеток с аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мкМ и воздействие радикалами HOO• демонстрировали возрастание мембранотоксического эффекта. Аскорбиновая кислота в этой концентрации усиливала деструктивное действие радикалов на мембраны мононуклеарных клеток — наблюдался прооксидантный эффект.

После определения профиля мембранотоксичности различных концентраций радикалов HOO• и аскорбиновой кислоты оценивали функциональные возможности мононуклеарных клеток.

Изучение активности интернализации частиц (эндоцитоз) клетками. Эндоцитоз является ключевым звеном врожденного иммунитета и модулируется различными физическими и химическими факторами, влияющими на клеточную сигнализацию и окислительно-востановительный баланс в тканях в норме и в процессе воспаления. Поэтому далее анализировали влияние аскорбиновой кислоты и радикала HOO• на активность эндоцитарных реакций и сохранение функциональных способностей мононуклеарными клетками крови.

В контрольной серии процент активных эндоцитирующих клеток составил 12,84% (IQR=3,7), при этом эндоцитарный индекс варьировал от 1,3 до 2,65 частиц на активную клетку (рис. 3).

Рис. 3. Эндоцитарная (интернализационная) активность мононуклеарных клеток крови после воздействия радикалами HOO•: а — количество активно эндоцитирующих клеток; б — эндоцитарный индекс (среднее количество частиц, поглощенных одной активной клеткой); * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05)

С увеличением концентрации радикалов увеличивалось количество активно эндоцитирующих клеток. Концентрация 200 мкМ увеличила эндоцитарную активность в 1,54 раза по сравнению с контрольной серией и способность к поглощению — до 3,09 частиц на одну клетку. Высокая концентрация HOO• (600 мкМ) увеличивала количество активных клеток в 1,72 раза по сравнению с контрольными значениями. Однако эндоцитарный индекс в этой серии не отличался от контроля, варьируя от 1,0 до 2,4 латексных частицы на клетку.

При анализе влияния радикалов HOO• на эндоцитарную активность тканевых мононуклеарных клеток селезенки также была обнаружена концентрационно-зависимая реакция стимуляции (рис. 4).

Рис. 4. Эндоцитарная (интернализационная) активность мононуклеарных клеток селезенки после инкубации с аскорбиновой кислотой, воздействия радикалами HOO• и комплексного воздействия радикалами HOO• и аскорбиновой кислотой. * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с соответствующими дозами после обработки только радикалами HOO• (р<0,05)

Воздействие радикалов HOO• в концентрации 600 мкМ увеличивало число эндоцитирующих клеток в 1,85 раза по сравнению с контролем, что на 13% больше, чем в серии с мононуклеарными клетками крови.

Инкубация только с аскорбиновой кислотой (10 мкМ) (см. рис. 4) увеличивала эндоцитарную активность в 2,05 раза по сравнению с контрольной серией.

Комбинированное воздействие радикалов и аскорбиновой кислоты в концентрации 10 мкМ стимулировало эндоцитарную активность мононуклеарных клеток селезенки по сравнению с контрольными значениями, но было ниже, чем активность клеток после инкубации с аскорбиновой кислотой в этой концентрации.

Предварительная обработка клеток только аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мкМ активировала эндоцитарную активность, однако при комбинированном воздействии значительно подавляла эндоцитарную активность при всех изученных концентрациях радикалов. Комбинированное воздействие аскорбиновой кислоты в концентрации 50 мкМ и радикалов в концентрации 600 мкМ снижало количество активно эндоцитирующих клеток в 2,75 раза по сравнению с контрольной серией и в 7,6 раза по сравнению с серией после воздействия радикалами в этой концентрации.

Исследование концентрации внутриклеточных АФК. Изучено влияние аскорбиновой кислоты и радикала HOO• на процесс образования АФК внутри клетки во время эндоцитоза в режиме реального времени. Установлено, что мононуклеарные клетки контрольной серии в процессе эндоцитоза демонстрировали характерную кинетическую картину физиологического «окислительного взрыва». Через 60 мин после начала эндоцитоза флуоресценция увеличилась на 29,6% (рис. 5). Увеличение флуоресценции зонда указывало на возрастание внутриклеточной концентрации АФК в процессе эндоцитоза.

Рис. 5. Кинетика генерации внутриклеточных активных форм кислорода (флуоресценция внутриклеточного зонда дигидрородамина 123) мононуклеарными клетками в течение 60 мин эндоцитоза после воздействия аскорбиновой кислотой и радикалами HOO•. АСК — аскорбиновая кислота; * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с серией после воздействия аскорбиновой кислотой и радикалами HOO• через 1 мин (р<0,05)

Инкубация клеток с 50 мкМ аскорбиновой кислоты вызывала статистически значимое увеличение флуоресценции и, следовательно, уровня АФК в начале эндоцитоза в 1,5 раза по сравнению с конт­ролем. Однако через 60 мин значения флуоресценции были аналогичны значениям контрольной серии через 60 мин.

Концентрация радикалов 200 мкМ вызвала устойчивую гиперактивную реакцию при уже повышенном исходном уровне флуоресценции. Через 60 мин наблюдалось увеличение флуоресценции в 1,6 раза, превышающее контрольные значения.

В клетках, обработанных радикалами HOO• в концентрации 600 мкМ, зафиксированы значительно более высокие уровни флуоресценции в начале процесса эндоцитоза. Значения были в 2,7 раза выше, чем в контроле, что указывает на активацию процессов генерации активных форм кислорода внутри клетки. Однако в течение 60 мин наблюдалось снижение уровня флуоресценции по сравнению с началом процесса, что указывает на торможение выработки АФК внутри клетки.

Анализ формирования внеклеточных ДНК-сетей. Исследована способность мононуклеарных клеток образовывать внеклеточные ДНК-сети в ответ на изучаемые стимулы.

В контрольной серии процент мононуклеарных клеток крови, образующих ДНК-сети, был низким (2%, IQR=3). Концентрации аскорбиновой кислоты 10 и 50 мкМ не стимулировали образование ДНК-сетей (рис. 6). После воздействия радикалами HOO• наблюдали концентрационно-зависимое возрастание количества ДНК-сетей мононуклеарных клеток крови. Концентрация HOO• в 600 мкМ вызывала заметное увеличение доли клеток, формирующих ДНК-сети (19%, IQR=12).

Рис. 6. Формирование внеклеточных ДНК-сетей мононуклеарными клетками через 60 мин после инкубации с аскорбиновой кислотой, воздействия радикалами HOO• и комплексного воздействия радикалами HOO• и аскорбиновой кислотой. * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с соответствующими дозами после обработки только радикалами HOO• (р<0,05)

Анализ образования внеклеточных ДНК-сетей в мононуклеарных клетках селезенки показал, что после 60 мин инкубации только 7,89% (IQR=2) клеток в конт­рольной серии образовали внеклеточные ДНК-сети.

Воздействие радикалов HOO• увеличивало образование внеклеточных ДНК-сетей в зависимости от дозы концентрации. HOO• в концентрации 200 и 600 мкМ увеличивал образование внеклеточных ДНК-сетей в 2,75 и 3,93 раза соответственно по сравнению с контрольной серией.

При анализе совместного эффекта аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• мы обнаружили, что предварительная обработка 10 мкМ аскорбиновой кислоты снижала образование внеклеточных ДНК-сетей, индуцированных радикалами HOO• 200 и 600 мкМ, дозозависимым образом в 2,4 и 1,65 раза соответственно.

Концентрация аскорбиновой кислоты 50 мкМ полностью подавляла образование внеклеточных ДНК-сетей, демонстрируя ингибирующее действие на процессы деконденсации хроматина и образование ДНК-сетей. Однако инкубация клеток с аскорбиновой кислотой в концентрации 50 мкМ с последующим воздействием радикалов HOO• не ингибировала образование внеклеточных ДНК-сетей.

Определение окислительной модификации белков клеток по уровню флуоресценции гликированых белков и триптофана. Для оценки влияния аскорбиновой кислоты и радикала HOO• на структурно-функциональную целостность мембранных и клеточных белков в процессе эндоцитоза мы исследовали собственную флуоресценцию аминокислоты триптофана. Триптофан вносит основной вклад в собственную флуоресценцию белков; снижение флуо­ресценции указывает на разрыхление (денатурацию) молекулы, изменение структуры и функции белка.

В клетках контрольной серии и клетках, обработанных 10 мкМ аскорбиновой кислоты, концентрация триптофана существенно не изменялась во время эндоцитоза (рис. 7, a).

Рис. 7. Флуоресценция триптофана (а) и гликированных белков (б) в мононуклеарных клетках через 1 мин и через 60 мин после воздействия аскорбиновой кислотой и гидропероксильными радикалами HOO•. АСК — аскорбиновая кислота; * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с соответствующими сериями через 1 мин после воздействия аскорбиновой кислотой и радикалами HOO• (р<0,05)

В мононуклеарных клетках крови, инкубированных с аскорбиновой кислотой 50 мкМ, регистрировалось снижение флуоресценции триптофана в 1,34 раза на старте эндоцитоза и в 1,77 раза через 60 мин по сравнению с контрольной серией.

После воздействия самой высокой концентрацией радикалов HOO• (600 мкМ) флуоресценция триптофана снизилась в 1,59 раза в начале эндоцитоза (p<0,01) и в 1,62 раза через 60 мин (p<0,01) по сравнению с контролем.

Для оценки степени молекулярной модификации мембранных белков мононуклеарных клеток мы количественно определили специфическую флуоресценцию, связанную с гликированными белками, обычно ассоциируемую с повреждением белковых комплексов и образованием конечных продуктов гликирования, которые возникают в результате неферментативных реакций между редуцирующими углеводами (способны участвовать в реакциях восстановления) и аминогруппами белков.

В контрольной группе через 60 мин после индукции эндоцитоза наблюдалось увеличение флуоресценции гликированных белков в 1,4 раза по сравнению с исходным уровнем (рис. 7, б).

В клетках, инкубированных с 10 мкМ аскорбиновой кислоты, флуоресценция гликированных белков снизилась в 1,4 раза по сравнению с контролем как через 1 мин, так и через 60 мин после индукции эндоцитоза. Напротив, в клетках, обработанных 50 мкМ аскорбиновой кислоты, наблюдалось увеличение флуоресценции в 1,3 раза по сравнению с контролем в обеих временных точках (1 и 60 мин).

Воздействие радикалов HOO• не оказало существенного влияния на флуоресценцию гликированных белков через 1 мин после начала эндоцитоза. Однако через 60 мин концентрация HOO• 600 мкМ снизила флуоресценцию в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой. Это возможно из-за ингибирования реакций гликирования, радикальной деградации образовавшихся продуктов или нарушения промежуточного метаболизма белков.

Анализ окислительно-восстановительного баланса клеток (уровень НАД+ и НАДН). Для оценки воздействия аскорбиновой кислоты и радикала HOO• на клеточный метаболизм мы исследовали спектры поглощения кофермента НАД+ и НАДН. Эти параметры отражают баланс окислительно-восстановительных процессов в клетке.

Анализ уровня НАД+ выявил изменения, зависящие от обработки (рис. 8, а). В контрольной группе уровни НАД+ оставались стабильными.

Рис. 8. Уровень НАД+ (а); НАДН (б) в мононуклеарных клетках через 1 мин и через 60 мин после воздействия аскорбиновой кислотой и радикалами HOO•. АСК — аскорбиновая кислота; * различия статистически значимы по сравнению с контрольной серией (р<0,05); # различия статистически значимы по сравнению с соответствующими сериями через 1 мин после воздействия аскорбиновой кислотой и гидропероксильными радикалами HOO• (р<0,05)

Клетки, обработанные аскорбиновой кислотой 50 мкМ, показали наибольшее увеличение уровня НАД+ в 1,30 раза через 1 мин и в 1,24 раза — через 60 мин по сравнению с контрольной серией.

Напротив, воздействие радикалов HOO• вызвало заметное снижение концентрации НАД+, т.е. окисленной формы кофермента. Через 60 мин в сериях после воздействия радикалами 40, 200 и 600 мкМ наблюдалось снижение в 1,45, 1,54 и 1,67 раза соответственно по сравнению с контролем.

Оценка концентрации НАДН показала, что в клетках, обработанных аскорбиновой кислотой 50 мкМ, наблюдалось снижение концентрации НАДН в 1,22 раза в начале эндоцитоза и в 1,41 раза — через 60 мин по сравнению с контрольной серией (рис. 8, б).

Воздействие радикалов HOO• также вызывало снижение концентрации НАДН, т.е. восстановленной формы кофермента. В серии с концентрацией радикалов 600 мкМ через 60 мин наблюдалось снижение в 1,39 раза по сравнению с контрольной серией.

Полученные результаты указывают на то, что эффект снижения уровня НАДН в клетках свидетельствует об изменении окислительно-восстановительного баланса и о преобладании реакций окисления, особенно после инкубации с 50 мкМ аскорбиновой кислоты.

Обсуждение

Анализ регуляторного потенциала радикалов НОО•, аскорбиновой кислоты и их комбинации является начальным этапом для изучения процессов регуляции формирования ДНК-сетей и интернализационной активности гетерогенной популяции мононуклеарных клеток. Использование суспензий нескольких клеток более точно отражает сложность иммунной микросреды in vivo, чем использование гомогенных клеточных линий или очищенных субпопуляций.

Оценка влияния аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• на мембранотоксичность (жизнеспособность) клеток. В данном исследовании целостность плазматической мембраны, оцениваемая с помощью окрашивания трипановым синим, показала, что воздействие аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• на мононуклеарные клетки вызывает дозозависимые мембранотоксические эффекты.

При низких концентрациях (10 мкМ) аскорбиновая кислота не влияла на целостность мембраны, действуя как водорастворимый антиоксидант. Аскорбиновая кислота, будучи гидрофильной, не внедряется в липидный бислой, и ее действие на липиды является косвенным [15, 16].

При низких концентрациях аскорбиновая кислота участвует в реакциях захватах одиночных радикалов, которые образуются в норме, и поглощается клеткой до того, как она сможет взаимодействовать с ионами переходных металлов [16]. Напротив, при высоких концентрациях (50 мкМ) аскорбиновая кислота восстанавливает Fe³⁺ до Fe²⁺, после чего активируется реакция Фентона (Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + HO• + OH^–). Образующиеся радикалы HO• (E°' ≈ +2,31 В) взаимодействуют с водородами полиненасыщенных жирных кислот, инициируя цепную реакцию перекисного окисления липидов, которая нарушает текучесть мембраны и образует гидрофильные поры или разрывы размером примерно 2,0–2,5 нм, что является эффективным диаметром для проникновения трипанового синего в клетку [2, 17, 18].

Наши результаты согласуются с литературными данными о том, что цитотоксичность высоких концентраций витамина C обусловлена чрезмерным образованием H₂O₂ внутри клетки через каталитическое восстановление ионов железа [19].

Радикалы HOO• представляют собой протонированную форму супероксид-аниона. В отличие от аскорбата, HOO• является нейтральным и умеренно липофильным соединением [20].

HOO• проявлял мембранотоксичность при концентрации ≥200 мкМ. Природа радикала HOO• позволяет ему диффундировать через бислой и непосредственно взаимодействовать с водородом из полиненасыщенных жирных кислот, инициируя процессы перекисного окисления. Радикалы HOO• запускают цепные реакции окисления липидов и белков, связывая и удаляя атомы водорода из полиненасыщенных жирных кислот в мембранах, создавая самоподдерживающиеся каскады свободнорадикальных повреждений [21, 20]. Кроме того, HOO• могут непосредственно окислять тиольные остатки трансмембранных белков, изменяя конформацию и нарушая их функцию. Например, в митохондриях радикальные реакции повреждают кардиолипин и запускают гибель клеток путем апоптоза [22, 23].

При совместном действии низкие концентрации аскорбиновой кислоты защищают мембраны от действия радикалов. На границе раздела вода–липид аскорбиновая кислота в своей моноанионной форме аскорбата (AH^–) отдает атом водорода пероксильным радикалам (LOO•). Образуется полудегидроаскорбатный радикал (A•^–), который стабилизируется резонансом между кислородом и сопряженной карбонильной двойной связью, тем самым защищая мембранные липиды от экзогенных НОО• и эндогенного перекисного окисления. Аскорбиновая кислота действует как антиоксидант. Кроме того, аскорбиновая кислота стимулирует работу системы глутатиона посредством дегидроаскорбат-редуктазы, что способствует поддержанию клеточного окислительно-восстановительного статуса [16, 24, 25].

Комбинирование аскорбиновой кислоты и HOO• в высоких концентрациях усиливало мембранотоксический эффект, что объясняется усилением окислительно-восстановительного цикла железа, в котором HOO• мобилизует Fe³⁺ из ферритина, а аскорбиновая кислота восстанавливает его до Fe²⁺, генерируя множество высокореактивных химических частиц HO• [26].

Постепенное уменьшение числа жизнеспособных клеток указывает на то, что с увеличением концентрации аскорбиновой кислоты и HOO• окислительный дисбаланс начинает перегружать клеточную защиту. В такой ситуации антиоксидантная система больше не может нейтрализовать свободные радикалы, что приводит к активации свободнорадикальных процессов и образованию большего количества пор в мембране [27].

Изучение активности интернализации частиц (эндоцитоз) клетками. Несмотря на мембранотоксический эффект, аскорбиновая кислота и радикалы HOO• независимо стимулировали процессы интернализации частиц клетками (эндоцитоз).

Аскорбиновая кислота защищает тиоловые группы белков (клатрин Cys 43, динамин Cys 607, Rab5 Cys 81), участвующих в эндоцитозе, одновременно генерируя сублетальные концентрации H₂O₂, которые активируют пути AMPK и ERK1/2, фосфорилируют Rab5 и рабенозин-5, а также регуляторные механизмы эндоцитоза и слияния эндосом [28, 29].

HOO•, несмотря на свой мембранотоксический эффект, активирует компенсаторные процессы, стимулирующие интернализацию частиц. Радикалы HOO• обратимо окисляют фосфатазы (PTEN Cys 124, PTP1B Cys 215) до сульфеновой кислоты
(–SOH), что приводит к их инактивации и обеспечивает устойчивую передачу сигналов в ядро (PI3K/Akt). Кроме того, радикалы HOO• активируют процессы полимеризации актина (Rac1/Cdc42) [30, 31].

Совместное действие высоких концентраций аскорбиновой кислоты и радикалов HOO• ингибировало эндоцитоз. Вероятно, это может быть связано с необратимым окислением эндоцитозных цистеинов до сульфиновой (–SO₂H)/сульфоновой (–SO₃H) кислоты группами HO•, образующимися при избытке аскорбиновой кислоты или в результате реакций с радикалом HOO•. Кроме того, процессы перекисного окисления липидов, активируемые в этих условиях, увеличивают жесткость мембраны, препятствуя процессам инвагинации, что снижает интернализационную активность клеток [32, 33].

Сравнение эндоцитарной активности мононуклеарных клеток периферической крови и селезенки выявило количественные различия их активности в изучаемых условиях. Клетки селезенки показали более выраженную стимуляцию эндоцитоза при воздействии HOO•. Это различие демонстрирует функциональную гетерогенность популяций макрофагов: макрофаги селезенки специализируются на захвате не только патогенов, но и поврежденных частиц и клеток собственного организма и могут иметь более мощный фагоцитарный механизм или более эффективные антиоксидантные системы [34, 35].

Исследование концентрации внутриклеточных АФК. Мониторинг внутриклеточной продукции АФК в режиме реального времени выявил закономерности, напрямую коррелирующие с функцией мононуклеарных клеток, — дозозависимое увеличение АФК. Это классический профиль окислительного взрыва: постепенное и устойчивое увеличение АФК в течение 60 мин после стимуляции отражает скоординированную активацию НАДФН-оксидазы и других систем, генерирующих АФК, что необходимо для интернализации частиц [36].

В клетках, инкубированных с высокими концентрациями аскорбиновой кислоты, механизм увеличения концентрации АФК является косвенным и зависит от наличия металлов переменной валентности: HO•, генерируемый в реакции Фентона во внеклеточном пространстве, окисляет мембранные липиды, образуя радикалы LOO•, которые диффундируют в клетку, а также генерирует перекись водорода, которая проникает через аквапорины [37].

С другой стороны, механизм увеличения концентрации АФК с помощью HOO• является прямым: благодаря своей липофильности HOO• диффундирует в цитозоль; участвует в таких реакциях, как окисление НАДН до НАД+ с образованием H₂O₂; мобилизует Fe²⁺ из ферритина и Fe-S центров, катализирующих внутриклеточные реакции Фентона; повреждает митохондрии, вызывая утечку митохондриальных АФК [38].

Важно отметить изменение кинетики образования внутриклеточных свободных радикалов, наблюдаемое в клетках, обработанных радикалами HOO• в высокой концентрации: высокие начальные уровни АФК (в 2,7 раза выше, чем в контрольной группе) сменялись снижением через 60 мин, что указывает на снижение активности клеточных оксидаз. Это функциональное истощение совпадает с максимальной индукцией образования внеклеточных ДНК-сетей, повреждением мембран и цитотоксичностью [39]. Снижение уровня внутриклеточных АФК на завершающих стадиях эндоцитоза может отражать истощение метаболических субстратов, окислительную инактивацию НАДФН-оксидазы из-за повреждения белков или переход к программам клеточной гибели, которые потребляют клеточные ресурсы и нарушают метаболизм [40]. Примечательно, что тот же кинетический профиль (высокий базовый уровень и последующее снижение концентрации АФК) был описан у нейтрофилов, переходящих в нетоз (NETosis), где устойчивое образование АФК необходимо для деконденсации хроматина [41].

Анализ формирования внеклеточных ДНК-сетей. Формирование внеклеточных ДНК-сетей продемонстрировало характерные закономерности в зависимости от агента и его комбинации.

Аскорбиновая кислота не активировала образование внеклеточных ДНК-сетей ни при одной из исследованных концентраций. В работе B.M. Mohammed с соавт. [42] было показано, что аскорбиновая кислота снижает экспрессию мРНК пептидил-аргинин деиминазы 4 (PAD4) и блокирует активацию сигнальных путей, необходимых для образования внеклеточных ДНК-сетей. В связи с этим мы предполагаем, что аскорбиновая кислота, подавляя экспрессию PAD4, может снижать цитруллинирование гистонов и, следовательно, деконденсацию хроматина. Известно, что активированные Т-лимфоциты в воспалительной микросреде могут высвобождать митохондриальную ДНК, действующую как DAMP, и усиливать воспаление через рецепторы TLR9 [43, 44].

В клинической практике было установлено, что внутривенное введение аскорбиновой кислоты пациентам с острым респираторным дистресс-синдромом, вызванным сепсисом, снижает тяжесть заболевания за счет уменьшения чрезмерного образования внеклеточных ловушек нейтрофилов [45].

HOO• дозозависимо увеличивает образование внеклеточных ДНК-сетей. Механизм включает активацию PAD4. HOO• окисляет регуляторные цистеины (Cys 409, 645) и стимулирует приток Ca²⁺ путем активации кальциевых каналов, необходимых для работы ферментов, участвующих в высвобождении ДНК. PAD4 активирует цитруллин и гистоны H3/H4, деконденсируя хроматин [43, 46].

Нами показано, что воздействие радикалов HOO• в концентрации 600 мкМ привело к активации образования внеклеточных ДНК-сетей, что коррелируют с полученными в настоящей работе данными о повреждении мембран клеток. Этот факт позволяет рассматривать гидропероксильный радикал как физиологически значимый индуктор внеклеточных ДНК-сетей из-за его способности вызывать свободнорадикальное повреждение цитоплазматической, ядерной и других мембран [47].

Одним из наиболее важных результатов нашего исследования является обнаруженная способность аскорбиновой кислоты в низкой концентрации значительно ингибировать образование внеклеточных ДНК-сетей, индуцированных радикалами HOO•. Это демонстрирует химическую нейтрализацию HOO• аскорбиновой кислотой, поддержание восстановленного (–SH) состояния цистеинов PAD4 внутриклеточной аскорбиновой кислотой и ингибирование PAD4 [48].

Такой защитный эффект предполагает, что аскорбиновая кислота нейтрализует радикалы и соответственно — свободнорадикальные реакции, необходимые для активации внутриклеточных молекулярных путей образования внеклеточных ДНК-сетей [16]. В клинической практике аскорбиновую кислоту используют в качестве ингибитора усиленного образования внеклеточных ДНК-сетей у пациентов с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, при которых чрезмерное образование внеклеточных ловушек является биомаркером, характеризующим тяжесть заболевания [49].

Сочетание высоких концентраций аскорбиновой кислоты с радикалами HOO• приводило к образованию внеклеточных ДНК-сетей, аналогичных тем, которые образуются при воздействии только HOO•. Усиленные процессы восстановления железа, активируемые в этих условиях, вызывают необратимое окисление PAD4 в клетках и повреждение ядра, что способствует высвобождению ДНК. Эти результаты отражают зависимый от концентрации потенциал действия аскорбиновой кислоты [2].

Определение окислительной модификации белков клеток по уровню флуоресценции гликированых белков и триптофана. Окислительную модификацию белков оценивали с использованием двух спектроскопических маркеров. Флуоресценция триптофана и гликозилированных белков выявляет молекулярные признаки повреждения белков [50]. Собственная флуоресценция триптофана является индикатором конформационного и функционального состояния белков. Замечено, что флуоресценция триптофана снижается в присутствии высоких концентраций аскорбиновой кислоты и радикалов HOO•.

Высокие концентрации аскорбиновой кислоты, как упоминалось выше, активируют реакцию Фентона, генерируя гидроксильный радикал. Он атакует индольное кольцо триптофана, образуя гидропероксид индола, который разлагается на N-формилкинуренин (NFK), или переносит атом водорода от связи N-H-ин­дола и других нелюминесцентных производных [51].

Воздействие высоких концентраций радикалов HOO• вызывало быстрое снижение флуоресценции триптофана, что указывает на повреждение белка с момента начала воздействия радикалов. Эффект HOO• обусловлен его способностью проникать через мембрану и достигать внутриклеточных белков, а также активировать пути формирования ДНК-сетей [52].

Флуоресценция гликозилированных белков увеличивалась при высоких и уменьшалась при низких концентрациях аскорбиновой кислоты и высоких концентрациях HOO•.

Снижение реакций гликирования белков предполагает, что при низких концентрациях аскорбиновая кислота не только предотвращает прямое повреждение свободными радикалами, но и ингибирует неферментативные реакции гликирования, которые физиологически происходят в процессе интернализации частиц [53]. Напротив, при высоких концентрациях аскорбиновая кислота окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты, гораздо более реакционноспособной, которая реагирует с лизинами, образуя флуоресцентные конечные продукты гликирования (AGEs). Эти результаты указывают на то, что преобладающим механизмом повреждения является гликоокисление, т.е. образование пиррол-липид-аминокислотных комплексов, включающих аргинин, лизин и пентозы/рибозы [54].

Возрастание продуктов гликирования приводит к активации НАДФН-оксидазы, генерации супероксид-анион-радикала, образованию пероксидов липидов и фосфолипидов мембран. Такие молекулярные модификации коррелируют с умеренной цитотоксичностью, повреждением мембран, частичным образованием внеклеточных ДНК-сетей и ингибированием эндоцитоза [55].

Воздействие высоких концентраций радикалов HOO• приводило к уменьшению количества гликозилированных белков в серии через 60 мин. Такая картина предполагает деградацию этих белков из-за избытка свободных радикалов или ингибирования их образования вследствие истощения карбонильных предшественников, перенаправленных клеткой на другие метаболические пути [56]. Такой профиль повреждений коррелирует с высокой цитотоксичностью, повреждением клеточной мембраны, интенсивным образованием внеклеточных ДНК-сетей и изменениями эффективности эндоцитоза.

Анализ окислительно-восстановительного баланса клеток (уровень НАД+ и НАДН). Концентрации НАД+ и НАДН представляют собой интегрированный сенсор клеточного окислительно-восстановительного и метаболического состояния, и дисбаланс в этом сенсоре может определять переход между функциональными программами, такими как эффективный эндоцитоз и формирование ДНК-сети.

При использовании аскорбиновой кислоты мы наблюдаем увеличение НАД+ и уменьшение НАДН, что приводит к увеличению соотношения НАД+/НАДН. Увеличение НАД+ отражает прямое окисление НАДН до НАД+ радикалом A•^– (семидегидроаскорбат) и образующимся H₂O₂ и/или активацию пентозофосфатного пути, что увеличивает выработку НАДФН и НАД+ [57]. Снижение НАДН объясняется повреждением митохондрий, вызванным HO• (перекисное окисление кардиолипина, инактивация комплекса I), что снижает выработку НАДН в цикле Кребса и дыхательной цепи. Таким образом, высокие уровни аскорбиновой кислоты создают состояние гипероксидации (высокий уровень НАД+, низкий уровень НАДН), характерное для нарушенного митохондриального метаболизма, но с возможностью регенерации НАД+ [58].

При высоких уровнях HOO• мы наблюдаем одновременное снижение уровней НАД+ и НАДН. Эти результаты могут отражать массивную активацию PARP1, который использует НАД+ для процессов клеточной репарации после повреждения клеток, вызванного HOO• [59]. Кроме того, HOO• напрямую окисляет НАДН, способствуя снижению его уровня. Повреждение митохондрий (перекисное окисление кардиолипина, инактивация аконитазы и инактивация комплекса I) дополнительно снижает выработку НАДН [60]. Наконец, инактивация NAMPT путем окисления его каталитического цистеина (Cys 263) блокирует синтез НАД+ из никотинамида, препятствуя восстановлению. Истощение запасов НАД+ особенно критично, поскольку эта молекула необходима для гликолиза и генерации аденозинтрифосфата, что объясняет неспособность поддерживать энергозатратные функции [61]. Результатом является коллапс общего запаса НАД+ и НАДН, что соответствует истощению энергии и гибели клетки по пути формирования внеклеточной ДНК-сети.

Ограничение исследования. Несмотря на то, что анализ реакций гетерогенной фракции мононуклеарных клеток на изучаемые стимулы позволяет оценить интегральный ответ популяции, необходимо отметить ряд ограничений настоящего исследования. Использование гетерогенной фракции мононуклеарных клеток не позволяет выделить вклад отдельных субпопуляций в наблюдаемые эффекты. Кроме того, исследование проводилось in vitro, что не полностью воспроизводит сложность иммунной микросреды in vivo. Для расширения понимания полученных эффектов in vitro далее будут выполнены эксперименты с использованием животных моделей.

Заключение

Полученные нами результаты имеют значение для понимания физиологии иммунного ответа. Оптимизация антиоксидантной активности может улучшить функционирование фагоцитов у пациентов с иммунодефицитными состояниями или генерализованными инфекциями.

Высокие концентрации аскорбиновой кислоты, ингибирующие фагоцитоз, указывают на потенциальные побочные эффекты высоких концентраций аскорбиновой кислоты в определенных условиях, особенно в сочетании с активными свободнорадикальными процессами и при некоторых патологиях (сепсис, радиационная болезнь, неопластические, нейродегенеративные процессы и др.).

Способность индуцировать контролируемый градиент окислительно-восстановительных реакций посредством эндогенных свободных радикалов позволяет моделировать пороговые значения функциональных переходов, предлагая ценный инструмент для токсикологических и иммуномодуляционных коррекций и исследований.

Способность радикалов HOO• активировать формирование ДНК-сетей мононуклеарными клетками селезенки и крови является результатом, который может быть использован для регуляции этого процесса при терапии госпитальных и других инфекций, когда необходима повышенная элиминация патогенов. Способность аскорбиновой кислоты блокировать образование ДНК-сетей, возможно, найдет свое применение в коррекции процессов метастазирования при некоторых неопластических процессах. Эти результаты могут иметь значение при разработке иммуномодулирующих и регулирующих стратегий как для иммунодефицитных, так и для аутоиммунных процессов.

Финансирование. Исследование проведено на средства Национального исследовательского Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского и собственные средства авторов.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.