Исследование фенотипа астроцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от здорового индивида и от пациента с болезнью Паркинсона, с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии

К.А. Кутукова, М.В. Иванов, Е.В. Новосадова, А.В. Брыдун, Е.Л. Арсеньева, Л.В. Новосадова, И.В. Кокорев, И.А. Гривенников, В.С. Сухоруков,

Ключевые слова: болезнь Паркинсона; индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; дифференцировка; электронная микроскопия; астроциты; LRRK2.

2009, номер 1, стр. 5.

DOI: https://doi.org/10.17691/stm2026.18.1.01

Полный текст статьи

html

Аннотация
Список литературы
Как цитировать в References

Цель исследования — изучить роль просвечивающей электронной микроскопии в оценке фенотипа астроцитов, полученных с помощью технологии направленной дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от здорового донора и от пациента с наследственной формой болезни Паркинсона (БП).

Материалы и методы. В работе использованы монослойные культуры астроцитов, дифференцированных из ИПСК от условно здорового донора и от пациента с БП, имеющего мутацию G2019S в гене LRRK2. Полученные глиальные культуры были охарактеризованы с помощью ПЦР в режиме реального времени и иммуноцитохимического окрашивания на глияспецифичные гены и белки. Ультраструктура астроцитов была исследована методом просвечивающей электронной микроскопии.

Результаты. ПЦР-исследование и иммуноцитохимическое окрашивание показали, что клеточные линии, полученные от условно здорового донора и от пациента с БП, экспрессировали необходимый паттерн глияспецифичных генов и синтезировали белки, характерные для астроцитов. При этом некоторые глияспецифичные гены экспрессировались мутантными клетками на пониженном уровне. Одним из наиболее типичных ультраструктурных признаков астроцитов, полученных из ИПСК от пациента с БП, были деструктивные изменения митохондрий, включающие их просветление, набухание, а также деструкцию крист. Во многих клетках при длительном культивировании митохондрии полностью отсутствовали. Другим характерным признаком клеток с мутацией в гене LRRK2 было накопление вакуолей с различным по электронной плотности содержимым. Резко выраженные изменения в культуре астроцитов с БП-ассоциированной мутацией в гене LRRK2 наблюдались и в ультраструктуре ядер, органелл белоксинтезирующего аппарата и элементов цитоскелета. При этом морфометрическое исследование не выявило различий в средних показателях площади клетки, площади ядра, площади цитоплазмы, ядерно-цитоплазматического соотношения между астроцитами контрольной линии и линии с БП-ассоциированной мутацией.

Заключение. Использование технологии репрограммирования с получением астроцитов из ИПСК от донора с БП-ассоциированной мутацией в гене LRRK2 позволяет оценить характер и динамику патологических морфохимических и ультраструктурных изменений, вызванных данной мутацией, в процессе глиогенеза. Применение комплекса методов (ПЦР, иммуноцитохимия, просвечивающая электронная микроскопия) для сравнения культур клеток, дифференцированных из ИПСК, дает возможность оценить, с одной стороны, общие для культуры параметры, например динамику дифференцировки культуры по изменению уровня экспрессии специфических генов и иммуноцитохимических маркеров, с другой — морфофункциональные изменения на уровне индивидуальных клеток. Применение метода просвечивающей электронной микроскопии демонстрирует значительный потенциал для исследования культур клеток, дифференцированных из ИПСК. Этот метод позволяет фенотипировать получившиеся клетки по их ультраструктуре, оценивать степень их морфологической зрелости, выявлять тонкие ультраструктурные изменения клеток как патологического характера, так и связанные с процессом дифференцировки. Результаты, полученные нами в настоящей работе с помощью метода электронной микроскопии и свидетельствующие о выраженном снижении жизнеспособности митохондрий и о других ультраструктурных нарушениях, подтверждают представление о значительной роли астроглии в развитии нейродегенеративного процесса при LRRK2-ассоциированной форме БП и могут служить основой для разработки новых подходов и поиска фармакологических мишеней в патогенетической терапии данного заболевания.

Lesage S., Brice A. Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors. Hum Mol Genet 2009; 18(R1): R48–R59, https://doi.org/10.1093/hmg/ddp012.
Trevisan L., Gaudio A., Monfrini E., Avanzino L., Di Fonzo A., Mandich P. Genetics in Parkinson's disease, state-of-the-art and future perspectives. Br Med Bull 2024; 149(1): 60–71, https://doi.org/10.1093/bmb/ldad035.
Paisán-Ruíz C., Jain S., Evans E.W., Gilks W.P., Simón J., van der Brug M., López de Munain A., Aparicio S., Gil A.M., Khan N., Johnson J., Martinez J.R., Nicholl D., Martí Carrera I., Pena A.S., de Silva R., Lees A., Martí-Massó J.F., Pérez-Tur J., Wood N.W., Singleton A.B. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron 2004; 44(4): 595–600, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2004.10.023.
Zimprich A., Biskup S., Leitner P., Lichtner P., Farrer M., Lincoln S., Kachergus J., Hulihan M., Uitti R.J., Calne D.B., Stoessl A.J., Pfeiffer R.F., Patenge N., Carbajal I.C., Vieregge P., Asmus F., Müller-Myhsok B., Dickson D.W., Meitinger T., Strom T.M., Wszolek Z.K., Gasser T. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron 2004; 44(4): 601–607, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2004.11.005.
Chen C., Soto G., Dumrongprechachan V., Bannon N., Kang S., Kozorovitskiy Y., Parisiadou L. Pathway-specific dysregulation of striatal excitatory synapses by LRRK2 mutations. Elife 2020; 9: e58997, https://doi.org/10.7554/eLife.58997.
MacLeod D., Dowman J., Hammond R., Leete T., Inoue K., Abeliovich A. The familial Parkinsonism gene LRRK2 regulates neurite process morphology. Neuron 2006; 52(4): 587–593, https://doi.org/10.1016/j.neuron.2006.10.008.
Plowey E.D., Cherra S.J. 3rd, Liu Y.J., Chu C.T. Role of autophagy in G2019S-LRRK2-associated neurite shortening in differentiated SH-SY5Y cells. J Neurochem 2008; 105(3): 1048–1056, https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2008.05217.x.
Friedman L.G., Lachenmayer M.L., Wang J., He L., Poulose S.M., Komatsu M., Holstein G.R., Yue Z. Disrupted autophagy leads to dopaminergic axon and dendrite degeneration and promotes presynaptic accumulation of α-synuclein and LRRK2 in the brain. J Neurosci 2012; 32(22): 7585–7593, https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.5809-11.2012.
Gómez-Suaga P., Luzón-Toro B., Churamani D., Zhang L., Bloor-Young D., Patel S., Woodman P.G., Churchill G.C., Hilfiker S. Leucine-rich repeat kinase 2 regulates autophagy through a calcium-dependent pathway involving NAADP. Hum Mol Genet 2012; 21(3): 511–525, https://doi.org/10.1093/hmg/ddr481.
Ramonet D., Daher J.P., Lin B.M., Stafa K., Kim J., Banerjee R., Westerlund M., Pletnikova O., Glauser L., Yang L., Liu Y., Swing D.A., Beal M.F., Troncoso J.C., McCaffery J.M., Jenkins N.A., Copeland N.G., Galter D., Thomas B., Lee M.K., Dawson T.M., Dawson V.L., Moore D.J. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One 2011; 6(4): e18568, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018568.
Alegre-Abarrategui J., Christian H., Lufino M.M., Mutihac R., Venda L.L., Ansorge O., Wade-Martins R. LRRK2 regulates autophagic activity and localizes to specific membrane microdomains in a novel human genomic reporter cellular model. Hum Mol Genet 2009; 18(21): 4022–4034, https://doi.org/10.1093/hmg/ddp346.
Streubel-Gallasch L., Giusti V., Sandre M., Tessari I., Plotegher N., Giusto E., Masato A., Iovino L., Battisti I., Arrigoni G., Shimshek D., Greggio E., Tremblay M.E., Bubacco L., Erlandsson A., Civiero L. Parkinson's disease-associated LRRK2 interferes with astrocyte-mediated alpha-synuclein clearance. Mol Neurobiol 2021; 58(7): 3119–3140, https://doi.org/10.1007/s12035-021-02327-8.
Miyazaki I., Asanuma M. Neuron-astrocyte interactions in Parkinson's disease. Cells 2020; 9(12): 2623, https://doi.org/10.3390/cells9122623.
Новосадова Е.В., Арсеньева Е.Л., Антонов С.А., Казанцева Е.А., Новосадова Л.В., Курко О.Д., Иллариошкин С.Н., Тарантул В.З., Гривенников И.А. Получение и характеристика глиальных клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Нейрохимия 2020; 37(4): 358–367, https://doi.org/10.31857/S1027813320040068.
Soubannier V., Maussion G., Chaineau M., Sigutova V., Rouleau G., Durcan T.M., Stifani S. Characterization of human iPSC-derived astrocytes with potential for disease modeling and drug discovery. Neurosci Lett 2020; 731: 135028, https://doi.org/10.1016/j.neulet.2020.135028.
de Rus Jacquet A., Tancredi J.L., Lemire A.L., DeSantis M.C., Li W.P., O'Shea E.K. The LRRK2 G2019S mutation alters astrocyte-to-neuron communication via extracellular vesicles and induces neuron atrophy in a human iPSC-derived model of Parkinson's disease. Elife 2021; 10: e73062, https://doi.org/10.7554/eLife.73062.
di Domenico A., Carola G., Calatayud C., Pons-Espinal M., Muñoz J.P., Richaud-Patin Y., Fernandez-Carasa I., Gut M., Faella A., Parameswaran J., Soriano J., Ferrer I., Tolosa E., Zorzano A., Cuervo A.M., Raya A., Consiglio A. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports 2019; 12(2): 213–229, https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2018.12.011.
Novosadova E.V., Nekrasov E.D., Chestkov I.V., Surdina A.V., Vasina E.M., Bogomazova A.N., Manuilova E.S., Arsenyeva E.L., Simonova V.V., Konovalova E.V., Fedotova E. Yu., Abramycheva N.Yu., Khaspekov L.G., Grivennikov I.A., Tarantul V.Z., Kiselev S.L., Illarioshkin S.N. A platform for studying molecular and cellular mechanisms of Parkinson’s disease based on human induced pluripotent stem cells. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(4): 157, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.4.20.
Lundin A., Delsing L., Clausen M., Ricchiuto P., Sanchez J., Sabirsh A., Ding M., Synnergren J., Zetterberg H., Brolén G., Hicks R., Herland A., Falk A. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports 2018; 10(3): 1030–1045, https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2018.01.021.
Nahirney P.C., Tremblay M.E. Brain ultrastructure: putting the pieces together. Front Cell Dev Biol 2021; 9: 629503, https://doi.org/10.3389/fcell.2021.629503.
Ramos-Gonzalez P., Mato S., Chara J.C., Verkhratsky A., Matute C., Cavaliere F. Astrocytic atrophy as a pathological feature of Parkinson's disease with LRRK2 mutation. NPJ Parkinsons Dis 2021; 7(1): 31, https://doi.org/10.1038/s41531-021-00175-w.
Smith W.W., Pei Z., Jiang H., Moore D.J., Liang Y., West A.B., Dawson V.L., Dawson T.M., Ross C.A. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) interacts with parkin, and mutant LRRK2 induces neuronal degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102(51): 18676–18681, https://doi.org/10.1073/pnas.0508052102.
Bak L.K., Walls A.B., Schousboe A., Waagepetersen H.S. Astrocytic glycogen metabolism in the healthy and diseased brain. J Biol Chem 2018; 293(19): 7108–7116, https://doi.org/10.1074/jbc.R117.803239.
Vetchinova A.S., Kapkaeva M.R., Ivanov M.V., Kutukova K.A., Mudzhiri N.M., Frumkina L.E., Brydun A.V., Sukhorukov V.S., Illarioshkin S.N. Mitochondrial dysfunction in dopaminergic neurons derived from patients with LRRK2- and SNCA-associated genetic forms of Parkinson's disease. Curr Issues Mol Biol 2023; 45(10): 8395–8411, https://doi.org/10.3390/cimb45100529.
Singh A., Zhi L., Zhang H. LRRK2 and mitochondria: recent advances and current views. Brain Res 2019; 1702: 96–104, https://doi.org/10.1016/j.brainres.2018.06.010.
Cherra S.J. 3rd, Steer E., Gusdon A.M., Kiselyov K., Chu C.T. Mutant LRRK2 elicits calcium imbalance and depletion of dendritic mitochondria in neurons. Am J Pathol 2013; 182(2): 474–484,
https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2012.10.027.
Lee J.H., Han J.H., Kim H., Park S.M., Joe E.H., Jou I. Parkinson's disease-associated LRRK2-G2019S mutant acts through regulation of SERCA activity to control ER stress in astrocytes. Acta Neuropathol Commun 2019; 7(1): 68, https://doi.org/10.1186/s40478-019-0716-4.
Matuz-Mares D., González-Andrade M., Araiza-Villanueva M.G., Vilchis-Landeros M.M., Vázquez-Meza H. Mitochondrial calcium: effects of its imbalance in disease. Antioxidants (Basel) 2022; 11(5): 801, https://doi.org/10.3390/antiox11050801.
Higgins C.M., Jung C., Xu Z. ALS-associated mutant SOD1G93A causes mitochondrial vacuolation by expansion of the intermembrane space and by involvement of SOD1 aggregation and peroxisomes. BMC Neurosci 2003; 4: 16, https://doi.org/10.1186/1471-2202-4-16.
Chaanine A.H. Morphological stages of mitochondrial vacuolar degeneration in phenylephrine-stressed cardiac myocytes and in animal models and human heart failure. Medicina (Kaunas) 2019; 55(6): 239, https://doi.org/10.3390/medicina55060239.
Lee S.J., Zhang J., Choi A.M., Kim H.P. Mitochondrial dysfunction induces formation of lipid droplets as a generalized response to stress. Oxid Med Cell Longev 2013; 2013: 327167, https://doi.org/10.1155/2013/327167.
Sánchez-Danés A., Richaud-Patin Y., Carballo-Carbajal I., Jiménez-Delgado S., Caig C., Mora S., Di Guglielmo C., Ezquerra M., Patel B., Giralt A., Canals J.M., Memo M., Alberch J., López-Barneo J., Vila M., Cuervo A.M., Tolosa E., Consiglio A., Raya A. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Mol Med 2012; 4(5): 380–395, https://doi.org/10.1002/emmm.201200215.
Liu L., Zhang K., Sandoval H., Yamamoto S., Jaiswal M., Sanz E., Li Z., Hui J., Graham B.H., Quintana A., Bellen H.J. Glial lipid droplets and ROS induced by mitochondrial defects promote neurodegeneration. Cell 2015; 160(1–2): 177–190, https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.12.019.
Mallick K., Paul S., Banerjee S., Banerjee S. Lipid droplets and neurodegeneration. Neuroscience 2024; 549: 13–23, https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2024.04.014.
Galper J., Kim W.S., Dzamko N. LRRK2 and lipid pathways: implications for Parkinson's disease. Biomolecules 2022; 12(11): 1597, https://doi.org/10.3390/biom12111597.

Kutukova K.A., Ivanov M.V., Novosadova E.V., Brydun A.V., Arsenyeva E.L., Novosadova L.V., Kokorev I.V., Grivennikov I.A., Sukhorukov V.S., Illarioshkin S.N. TEM-based Study of the Phenotype of Astrocytes Differentiated from Induced Pluripotent Stem Cells from a Healthy Donor and a Patient with Parkinson’s Disease. Sovremennye tehnologii v medicine 2009; (1): 5, https://doi.org/10.17691/stm2026.18.1.01