Чувствительность клеток линии Hela Kyoto, трансфицированных сенсором HyPer2, к действию цисплатина

Цисплатин — химиотерапевтический препарат, используемый в клинической практике для лечения широкого ряда злокачественных новообразований. Он вызывает повреждения ДНК [1], а также индуцирует продукцию активных форм кислорода (АФК), инициирующих гибель опухолевой клетки [2, 3]. В настоящее время с целью оценки участия конкретных форм АФК в реакции клетки на разнообразные внешние воздействия, в том числе терапевтические, все шире используются генетически-кодируемые сенсоры на основе флюоресцентных белков [4–9]. Преимуществами данных сенсоров являются высокая специфичность и возможность длительных динамических исследований. Тем не менее в случае изучения цитотоксических эффектов лекарств в отношении трансфицированных клеточных линий важно учитывать возможность влияния чужеродных белков, присутствующих в клетках, на их чувствительность к действию применяемых препаратов [10, 11]. Для этого необходимо осуществлять сравнительную оценку цитотоксического действия химиотерапевтических агентов в отношении трансфицированных и исходных клеточных линий.

Кроме того, в механизме действия цисплатина продемонстрирован ряд дозозависимых эффектов, таких как влияние на пути клеточной гибели, сигнальные каскады, гликолитическая активность и др. [12, 13], поэтому важным аспектом при изучении механизмов воздействия цитотоксического агента является выбор оптимальных рабочих доз препарата.

Цель исследования — с использованием МТТ-теста провести сравнение цитотоксического действия цисплатина в отношении клеток линии HeLa Kyoto и линии HeLa Kyoto, содержащей генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer2 (линия HeLa Kyoto–HyPer2), и с помощью метода окрашивания трипановым синим выявить дозы цисплатина, вызывающие гибель клеток при различных сроках воздей­ствия.

Материалы и методы. В работе использованы две клеточные линии: линия карциномы шейки матки человека HeLa Kyoto и та же клеточная линия, трансфицированная генетически-кодируемым цитоплазматическим сенсором HyPer2, который предназначен для динамического исследования уровня внутриклеточного пероксида водорода (HeLa Kyoto–HyPer2) [14]. Клеточные линии были предоставлены Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Россия). Анализ цитотоксического действия цисплатина в отношении клеток данных линий проведен с помощью МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ в жизнеспособных клетках конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Измерение концентрации формазана в растворе после взаимодействия с диметилсульфоксидом (ДМСО) позволяет оценить количество жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях — специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным агентом [15].

Клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 3000 клеток на 1 лунку в 200 мкл среды DMEM (англ. Dulbecco’s Modified Eagle Medium) («ПанЭко», Россия), содержащей 2 ммоль/л глутамина и 10% FBS (HyClone, США), затем помещали в СО₂-инкубатор на 24 ч (37,0°С, 5% СО₂). Через сутки производили замену исходной среды на среду DMEM с глутамином и 10% FBS, содержащую цисплатин. Концентрации цисплатина варьировали от 0 до 50 мкмоль/л. Еще через сутки производили смену питательной среды на среду с МТТ (0,5 мг/мл), по 200 мкл на лунку. Планшет помещали в СО₂-инкубатор на 4 ч, после чего среду с МТТ отбирали, в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО и экстрагировали образовавшийся формазан в течение 40 мин при постоянном помешивании. Оптическую плотность полученного раствора формазана в ДМСО измеряли на планшетном спектрофотометре Synergy MX (BioTek, США) при длине волны 570 нм. За 100% жизнеспособность принимали интенсивность окраски в лунках с клетками, не обработанными цисплатином. На графике зависимости количества жизнеспособных клеток от концентрации цисплатина (рис. 1) представлены средние значения по данным шести экспериментов для HeLa Kyoto–HyPer2 и трех экспериментов для HeLa Kyoto, каждый из которых выполнен в трехкратной повторности, и стандартные ошибки среднего. Построение кривых цитотоксичности, определение дозы, вызывающей потерю жизнеспособности 50% клеток (IC₅₀), определение 95% доверительного интервала,проведение нелинейной регрессии и сравнение кривых по IC₅₀ и наклону кривой осуществляли в программе GraphPad Prism 6.01. Уровень статистической значимости различий между значениями IC₅₀, полученными при обработке цисплатином исходных и трансфицированных клеток HeLa Kyoto, определяли по критерию Фишера. Статистически значимыми признавались значения p<0,05.

Рис. 1. Ингибирующий эффект различных концентраций цисплатина на линии HeLa Kyoto и HeLa Kyoto–HyPer2 (МТТ-тест)

С использованием метода окрашивания трипановым синим [16] для линии HeLa Kyoto-HyPer2 вычисляли процентное содержание погибших и живых клеток после инкубации с цисплатином в различных концентрациях. Метод основан на способности красителя проникать внутрь клетки сквозь поврежденные мембраны, живые клетки при этом не окрашиваются.

За сутки до этого эксперимента клетки высаживались на 12-луночный планшет в количестве 150 тыс. клеток на лунку. Культивирование проводилось в среде DMEM с 2 ммоль/л глутамина и 10% FBS. Время экспозиции с препаратом в концентрации, соответствующей IC₅₀ (8,3 мкмоль/л), составляло от 0 до 24 ч с интервалом 2 ч. Время экспозиции с препаратом в концентрациях 13; 26; 52; 104; 208,3; 416,7; 833,3 мкмоль/л — 2, 4, 6, 8, 24 ч. В контроле к клеткам добавляли среду DMEM с 2 ммоль/л глутамина с 10% FBS без цисплатина. Время экспозиции составляло от 0 до 24 ч с интервалом 2 ч. После экспозиции среда из лунок переносилась в микроцентрифужные пробирки. Клетки снимали раствором трипсина–Версена (1:1) в количестве 750 мкл, экспозиция — 5–7 мин в СО₂-инкубаторе. Затем все содержимое лунки переносилось в соответствующую микроцентрифужную пробирку. Клетки были процентрифугированы на вортексе «Фуга/вортекс микроспин FV-2400» (BioSan, Латвия, 2400 об./мин) в течение 5 мин. После удаления над­осадочной жидкости к клеткам добавляли раствор PBS (700 мкл). Для окраски использовали 0,4% раствор трипанового синего. Подсчет клеток выполняли в камере Горяева, результаты выражались в процентах живых и погибших клеток от общего их количества. Вычисляли средние арифметические значения, полученные в двукратной повторности в трех лунках, и их стандартные ошибки.

Результаты. По данным МТТ-теста построена кривая зависимости жизнеспособности клеток HeLa Kyoto и HeLa Kyoto–HyPer2 от концентрации цисплатина в среде (см. рис. 1). Установлено, что концентрация IC₅₀, которая соответствует дозе, вызывающей потерю жизнеспособности 50% клеток (с 95-процентным доверительным интервалом), составляет для HeLa Kyoto–HyPer2 8,3 мкмоль/л [7,307; 9,447], а для HeLa Kyoto — 10,5 мкмоль/л [8,4; 13,9]. Различия между значениями IC₅₀ для исследованных клеточных линий оказались статистически значимыми (р=0,04).

Проведенное окрашивание трипановым синим (рис. 2, 3) позволило оценить дозо-временную зависимость ответа клеток линии HeLa Kyoto–HyPer2 на воздействие цисплатина. Выявлено, что число погибших клеток при воздействии данного препарата в концентрации IC₅₀ начинает увеличиваться через 14 ч и продолжает нарастать до 24 ч (до конца эксперимента, рис. 2, б). К 24 ч количество погибших после обработки цисплатином клеток по сравнению с необработанными контрольными клетками повышается в среднем с 2,7±1,7 до 12,7±1,5% (рис. 2, а, б). Важно, что общее число клеток в присутствии цисплатина не увеличивается, т.е. не происходит их деления, в то время как число контрольных необработанных клеток растет в среднем в 2,3 раза (рис. 2, в). При более высоких дозах препарата отмечено снижение количества живых клеток с 95,5±0,2 до 40,3±6,0% уже через 4 ч, а также гибель 80–90% клеток к 6 ч (833,3 мкмоль/л, рис. 3, в).

Рис. 2. Количество живых и погибших клеток линии HeLa Kyoto–HyPer2 в контроле (а), после воздействия цисплатина в дозе IC50 (б) и общее количество клеток в контроле и после воздействия цисплатина (в) при различных временах инкубации (окрашивание трипановым синим)

Рис. 3. Количество живых и погибших клеток линии HeLa Kyoto–HyPer2 после воздействия цисплатина в различных концентрациях при различных временах инкубации: а — 2 ч; б — 4 ч; в — 6 ч; г — 8 ч; д — 24 ч (окрашивание трипановым синим)

Обсуждение. Изучение цитотоксического действия цисплатина в отношении клеточных линий HeLa Kyoto и HeLa Kyoto–HyPer2 с использованием стандартного МТТ-теста, а также окрашивания трипановым синим позволило определить концентрацию препарата, вызывающую гибель определенного числа клеток.

Согласно данным МТТ-теста, кривые цитотоксичности обеих линий клеток имеют сходную динамику, что говорит о схожей их чувствительности к действию препарата. Поскольку колено кривых относительно короткое и их наклон несколько круче стандартного [17] (наклон кривой для HeLa Kyoto: –1,876 [–2,583; –1,170], для HeLa Kyoto–HyPer2: –2,196 [–2,739; –1,652]), можно сделать вывод об относительно высокой чувствительности обеих линий к препарату.

Значение IC₅₀, полученное в нашей работе, сопоставимо со значениями, представленными в работе [18] для линии HeLa. По данным регрессионного анализа, для трансфицированных клеток HeLa Kyoto значение IC₅₀ оказалось в 1,3 раза меньше, чем для нетрансфицированных (см. рис. 1). Это свидетельствует о несколько более высокой чувствительности клеток HeLa Kyoto, содержащих сенсор HyPer2, к действию препарата цисплатина, что может быть связано с наличием в клетке флюоресцентного белка. Источники такой повышенной чувствительности трансфицированных клеток могут быть различными. Так, имеются данные об индукции окислительного стресса, вызванного введением в клетку зеленого флюоресцентного белка (GFP), и о соответствующем повышении чувствительности трансфицированных клеточных линий к действию таких химиотерапевтических агентов, как карбоплатин, доксорубицин, этопозид и мелфалан, по сравнению с клетками дикого типа [10]. Повышенная чувствительность к противоопухолевым препаратам клеток, трансфицированных белком GFP или его аналогами (желтым флюоресцентным белком или «усиленным» GFP) тесно связана с продукцией АФК, в частности синглетного кислорода [11]. При этом клетки в ответ на трансфекцию белка GFP и вызываемый им окислительный стресс повышают продукцию глутатиона [10]. Можно предположить, что перечисленные факторы лежат и в основе снижения устойчивости линии HeLa Kyoto–HyPer2 по сравнению с HeLa Kyoto.

Наше исследование продемонстрировало, что выявленное по результатам МТТ-теста 50% снижение жизнеспособности клеток HeLa Kyoto–HyPer2 при действии цисплатина в концентрации IC₅₀ через 24 ч инкубации определяется не столько гибелью клеток, сколько торможением их деления (см. рис. 2).

С целью определения доз цисплатина, вызывающих клеточную гибель в сроки до 24 ч, был использован ряд возрастающих доз препарата (от 13 мкмоль/л, что превышает IC₅₀ по результатам МТТ-теста в 1,6 раза и приблизительно соответствует дозе, вызывающей потерю жизнеспособности 80% клеток по результатам МТТ-теста, до сверхвысоких доз). Повышение концентрации препарата вызывало более быструю гибель клеток (см. рис. 3).

В работе [12] показано, что как для нормальных, так и для опухолевых клеток концентрации цисплатина менее 30 мкмоль/л вызывают в большинстве случаев развитие апоптоза, концентрации более 300 мкмоль/л индуцируют гибель по пути некроза, при обработке цисплатином в концентрации 100 мкмоль/л регистрируются оба пути клеточной гибели. Авторы фиксировали характерные признаки развития некроза и апоптоза начиная с 8 ч с момента начала воздействия независимо от концентрации препарата. Методы, использованные в нашем исследовании, не дают возможности сделать точный вывод о путях гибели клеток HeLa Kyoto–HyPer2 после воздействия цисплатина (витальный краситель трипановый синий окрашивает клетки, погибшие как по пути некроза, так и по пути апоптоза [16]), но позволяют определить дозо-временные параметры воздействия.

По результатам окраски клеток трипановым синим выявлено, что мембраны клеток демонстрируют повреждения преимущественно после 8 ч уже при относительно низких концентрациях цисплатина — от 52 мкмоль/л. На этапе 4 и 6 ч клетки окрашивались лишь при экспозиции с цисплатином в концентрациях свыше 416,7 мкмоль/л. Следовательно, вероятные процессы некроза или позднего апоптоза, повреждающие мембраны, запускаются при малой временнόй экспозиции лишь при высоких концентрациях. Более низкие концентрации препарата также способны привести к некрозу и позднему апоптозу при условии длительного воздействия. По-видимому, при небольших концентрациях, сопоставимых с IC₅₀, происходит ингибирование деления клеток, не приводящее к их гибели в течение 24 ч. При более высоких концентрациях — до 52 мкмоль/л — если и происходит гибель клеток, то она связана с процессами раннего апоптоза в течение первых 8 ч экспозиции (такие клетки не окрашиваются трипановым синим), после этого времени можно наблюдать поздний апоптоз и некроз. Высокие концентрации препарата способны приводить к гибели клеток уже при небольших экспозициях.

Полученные результаты представляются весьма важными в нескольких отношениях. Во-первых, различия в чувствительности клеточных линий и дозозависимые эффекты воздействия, выявленные в ходе исследования, необходимо учитывать при расчете оптимальных рабочих концентраций препарата. Во-вторых, результаты исследования необходимы для понимания закономерностей токсического действия препарата в отношении линии HeLa Kyoto–HyPer2, несущей генетически-кодируемый сенсор, и дальнейшего ее использования при анализе роли пероксида водорода в механизме клеточной гибели, индуцированной цисплатином.

Заключение. Сравнительное исследование эффектов цисплатина в отношении клеточных линий HeLa Kyoto и HeLa Kyoto–HyPer2 выявило, что трансфекция клеток флюоресцентным белком вызывает статистически значимое повышение чувствительности к препарату. Концентрация цисплатина, соответствующая IC₅₀, при воздействии в течение 24 ч не приводит к гибели клеток HeLa Kyoto–HyPer2, а вызывает торможение их деления. При концентрациях цисплатина менее 52 мкмоль/л повреждение мембран не проявляется в течение 8 ч, а в случае использования высоких концентраций — 416,7 мкмоль/л — повреждение возможно уже после 4 ч экспозиции. Вероятно, временной промежуток от 0 до 8 ч после добавления цисплатина в дозе менее 52 мкмоль/л является оптимальным для изучения процессов раннего апоптоза у данной линии опухолевых клеток. Полученные данные следует учитывать при изучении молекулярных механизмов развития повреждения нормальных и опухолевых клеток под воздейст­вием цисплатина с использованием генетически-кодируемых сенсоров.

Финансирование исследования. Гранты РФФИ (№13-04-97165, №13-04-40228-Н), гранты Министерства образования и науки Российской Федерации (№11.G 34. 31.0017, №14.Z50.31.0022).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности. Авторы выражают благодарность д.б.н. Лукьянову С.А. и д.б.н. Белоусову В.В. за предоставленные линии клеток, к.б.н. Балалаевой И.В., к.б.н. Здобновой Т.А. и Соколовой Е.А. за помощь при подготовке и проведении экспериментов, а также при анализе данных.