Антигипоксические и нейропротективные свойства нейротрофических факторов BDNF и GDNF при гипоксии in vitro и in vivo

Для защиты клеток головного мозга от губительного действия гипоксии в настоящее время активно разрабатываются различные терапевтические подходы, связанные с использованием эндогенных соединений или их производных для коррекции неврологического статуса. Согласно современным представлениям, нейротрофические факторы играют ключевую роль в функционировании нейронных сетей головного мозга в процессе развития и в постнатальный период [1, 2]. Нейротрофины способствуют сохранению жизнеспособности клеток головного мозга на высоком метаболическом уровне при воздействии стресс-факторов. Механизмы защитного действия глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) взаимосвязаны и реализуются через однонаправленные реакции поддержания гомеостаза нейронных сетей. Взаимодействие этих нейротрофических факторов с высокоселективными рецепторами на поверхности клетки приводит к активации защитных MAP-киназных (МАРК) сигнальных путей [3–7]. Однако вопрос о предполагаемом синергизме данных нейротрофинов остается открытым. Ранее, в экспериментах in vivo и in vitro [8, 9], нами было показано, что превентивное введение нейротрофического фактора головного мозга нивелирует отрицательные последствия гипоксии. Совместное применение нейротрофических факторов может усилить активационные внутриклеточные каскады и увеличить защитное действие каждого из факторов.

Цель исследования — оценить антигипоксические и нейропротективные свойства BDNF и GDNF при моделировании гипоксии in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Эксперименты in vitro. В исследовании использованы первичные диссоциированные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов мышей линии СВА. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации» и были согласованы с Этическим комитетом НижГМА. Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0,25% трипсином (Gipco, CША). Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде Neurobasal™ (Invitrogen, США) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой («ПанЭко», Россия) и культивировали, согласно ранее разработанному протоколу [10], в течение 30 дней in vitro (DIV) на мультиэлектродной матрице системы MEА60 (Multiсhannel Systems, Германия), содержащей 60 микроэлектродов. Предварительно матрицу стерилизовали УФ-облучением и обрабатывали полиэтиленимином (Sigma, США), служившим опорным субстратом для культивируемых клеток. Исходная плотность культуры на матрице составляла 9000 кл./мм². Жизнеспособность культур поддерживалась в СО₂-ин­кубаторе при температуре 35,5^оС, в газовой смеси, содержащей и 5% СО₂ [10]. Для количественной обработки и анализа полученных данных использовали набор программного обеспечения МС Rack™ (Multichannel Systems, Германия), а также пакет прикладных программ Matlab.

Моделирование гипоксии проводили на 14-й день культивирования путем замены культуральной среды на среду c низким содержанием кислорода на 10 мин. Вытеснение кислорода осуществлялось за счет насыщения культуральной среды инертным газом. Эксперимент проводили в герметичной камере, в которой воздух также был замещен на инертный газ. Исследуемые вещества добавляли в культуральную среду за 20 мин до моделирования гипоксии. Параметры, характеризующие ответную реакцию первичной культуры гиппокампа на гипоксию, регистрировали через 2 ч и каждые 24 ч в течение 7 дней после гипоксии.

Оценку жизнеспособности клеток в диссоциированных культурах осуществляли подсчетом числа клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом (Sigma), — мертвые клетки и ядер, окрашенных бис-бензимидом (Sigma), — все клетки культуры. Количество живых клеток рассчитывали как процентное соотношение между бис-бензимид-позитивными и пропидий-иодид-позитивными клетками.

Эксперименты in vivo. Исследования были выполнены на 86 половозрелых самцах мышей линии C57BL/6j массой 18–20 г. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации», этическим принципам, установленным Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.), и согласованы с Этическим комитетом НижГМА.

Методы исследования. Для моделирования острой гипобарической гипоксии использовали вакуумную проточную барокамеру при внешней температуре 20–22^оС. Мыши помещались в условия, соответствующие подъему на критическую высоту 10 500 м со скоростью 183 м/с [11]. Степень резистентности к гипоксии оценивали по времени жизни на «высоте» (Т_ж, мин), которое определялось от момента подъема на высоту до наступления смерти животного или появления второго агонального вдоха, и по времени потери позы (Т_пп, мин) — периода от начала подъема в барокамере до момента, когда животное принимает боковое положение и утрачивает способность поддерживать позу. Т_ж использовали для градации животных по степени устойчивости к гипоксии, разделяя их на три группы: низкоустойчивые к гипоксии особи (Т_ж — менее 3 мин), среднеустойчивые (Т_ж — от 3 до 9 мин) и высокоустойчивые (Т_ж — более 9 мин без видимых проявлений гипоксического повреждения). Для сравнительной оценки эффективности антигипоксического действия применяли коэффициент защиты (К_з), рассчитывае­мый по выживаемости животных на «смертельной площадке» более 10 мин.

К_з=(а/б+1)/(в/д+1),

где а и б — число выживших животных в опытной и контрольной группах; в и д — общее число животных в опытной и контрольной группах [11].

Для оценки нейропротективных свойств нейротрофических факторов использовали тестирование животных в тесте «Водный лабиринт Морриса». Данный тест проводили по стандартной методике [12], модифицированной для мышей (диаметр бассейна — 90 см, диаметр скрытой в воде платформы — 10 см). Траекторию движения животного фиксировали с помощью установки для видеорегистрации объектов, анализ данных выполняли с помощью разработанного в программной среде Matlab оригинального пакета алгоритмов MouseTrack и Traceman. Отбирались животные, способные к обучению и формированию пространственной памяти. Показателями эффективности научения служили время, затраченное на решение задачи, и форма траектории свободного плавания. Количественную оценку этого критерия выполняли с помощью коэффициента сохранения (Кс), значение которого равняется отношению суммы длительностей периодов времени, затраченного на нахождение платформы (латентных периодов) в первом сеансе, к сумме латентных периодов в каком-либо из последующих сеансов (Кс2 — отражает выполнение задачи во втором сеансе научения по сравнению с первым; Кс3 — в третьем сеансе по сравнению с первым и т.д.). Соответственно, чем выше Кс, тем быстрее происходит научение.

Через сутки после гипоксии проводили тестирование на сохранение долговременной памяти: тест состоял из одной пробы длительностью 60 с. При этом платформа в лабиринте отсутствовала. Определяли отсроченный коэффициент сохранения (оКс), т.е. долю времени пребывания животного в квадранте, где находилась платформа, по отношению к общему времени пребывания в водном лабиринте Морриса. При этом считалось нормой, если животное провело в квадранте, где находилась платформа, 23–27% общего времени пребывания в лабиринте [13, 14]. Также оценивали форму траектории свободного плавания при поиске платформы.

Статистический анализ данных. Достоверность различий между экспериментальными группами определяли с помощью пакета программ ANOVA. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты. На первом этапе исследований проведена оценка влияния нейротрофических факторов (BDNF, GDNF) на сохранение спонтанной биоэлектрической активности первичных диссоциированных культур гиппокампа. К 14-му дню развития in vitro в первичных диссоциированных культурах гиппокампа развивается стабильная сетевая спонтанная биоэлектрическая активность [10]. Исследования морфофункциональной структуры нейронных сетей первичной диссоциированной культуры гиппокампа показали не только стабилизацию основных показателей биоэлектрической активности (числа малых сетевых пачек, количества спайков в пачке) к 14-му дню развития in vitro, но и появление сложных аксоно-дендрических и аксоно-сомических синапсов [15, 16]. Гипоксия приводит к необратимым деструктивным изменениям в функциональной сетевой активности первичных диссоциированных культур [8, 17]. Через 7 сут после воздействия гипоксии наблюдается полное разрушение спонтанной биоэлектрической сетевой активности. Только в 32,4% культур, подвергшихся действию гипоксии, сохраняется сетевая пачечная активность с измененным паттерном малых сетевых пачек (рис. 1).

Рис. 1. Спонтанная биоэлектрическая активность диссоциированных культур клеток гиппокампа после моделирования острой нормобарической гипоксии (n=36). Данные нормированы относительно исходного уровня: а — количество малых сетевых пачек; б — количество спайков в пачке; * — статистически значимые различия с исходным уровнем; # — с группой «гипоксия»; ANOVA, p<0,05

Превентивное введение нейротрофических факторов BDNF (1 нг/мл) и GDNF (1 нг/мл) частично нивелирует отрицательное действие гипоксии на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур. Установлено, что применение нейротрофических факторов статистически значимо (р<0,05) увеличивает количество малых сетевых пачек через сутки после воздействия. Изучение паттернов активности через сутки после моделирования нормобарической гипоксии показало, что превентивное введение нейротрофических факторов (BDNF, 1 нг/мл и GDNF, 1 нг/мл) способствует и сохранению структуры сетевой пачки, а следовательно, морфофункциональной структуры нейронных сетей первичной диссоциированной культуры гиппокампа (рис. 2).

Рис. 2. Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности диссоциированной культуры гиппокампа (снизу): а — активность контрольной культуры до гипоксии и через 24 ч после реоксигенации; б — активность культуры до аппликации BDNF (1 нг/мл) и гипоксии и через 24 ч после аппликации BDNF и реоксигенации; в — активность культуры до аппликации GDNF (1 нг/мл) и гипоксии и через 24 ч после аппликации GDNF и реоксигенации

Исследования, проведенные в более отдаленный период, показали, что в случае применения GDNF (1 нг/мл) среднее количество спайков в пачке через 3 сут после воздействия статистически значимо (р<0,05) выше, чем в группе «гипоксия» — 2213,54±256,43 и 465,67±97,21 соответственно. Коли­чество малых сетевых пачек во всех опытных группах в данный период было статистически значимо (р<0,05) меньше, чем до воздействия.

Через 7 сут после воздействия гипоксии в группах с превентивным введением обоих нейротрофических факторов наблюдается восстановление количества малых сетевых пачек и среднего количества спайков в пачке до исходного уровня (статистически значимых различий с уровнем до воздействия не обнаружено). При этом показатели спонтанной биоэлектрической активности в группах с превентивным введением нейротрофических факторов оказались статистически значимо (р<0,05) выше, чем в группе «гипоксия».

На следующем этапе была проведена оценка жизнеспособности клеток в первичной диссоциированной культуре гиппокампа после моделирования нормобарической гипоксии. Установлено, что оба используемых нейротрофических фактора в дозе 1 нг/мл обладают выраженным цитозащитным дейст­вием, которое характеризуется уменьшением количества мертвых клеток в течение 7 сут постгипоксического периода.

При исследовании совместного действия нейротрофинов (BDNF, 1 нг/мл + GDNF, 1 нг/мл) не обнаружено усиления цитопротективного эффекта (рис. 3). Количественная оценка жизнеспособности клеток в культуре показала, что в группе с совместным применением нейротрофинов процент мертвых клеток выше, чем в группах с изолированным применением факторов. Таким образом, при исследовании жизнеспособности клеток в первичной диссоциированной культуре не обнаружено усиления действия нейротрофических факторов при их совместном применении.

Рис. 3. Количество мертвых (пропидиум иодид-положительных) клеток в диссоциированных культурах гиппокампа на 1, 3 и 7-е сутки постгипоксического периода (n=36). Данные нормированы относительно группы «нормоксия»; * — статистическая значимость различий с группой «нормоксия»; # — с группой «гипоксия»; ANOVA, p<0,05

Исследование дозозависимого действия нейротрофических факторов не обнаружило достоверных изменений в количестве мертвых клеток через 7 сут после моделирования гипоксии. Так, при увеличении концентрации BDNF в поздний постгипоксический период до 10 нг/мл наблюдалась тенденция к уменьшению количества мертвых клеток (1 нг/мл — 12,34±3,54%, 10 нг/мл — 9,65±2,87%). Повышение концентрации нейротрофического фактора GDNF, напротив, вызывало незначительное увеличение количества мертвых (пропидиум иодид-положительных) клеток через 7 сут после воздействия (1 нг/мл — 11,15±3,14%, 10 нг/мл — 14,09±4,28%).

На следующем этапе проведено исследование действия нейротрофических факторов (BDNF, GDNF) на устойчивость животных к условиям острой гипобарической гипоксии. Выявлено, что превентивное введение нейротрофических факторов увеличивает устойчивость животных к условиям острой гипобарической гипоксии (табл. 1). Применение нейротрофических факторов BDNF (4 мг/кг) и GDNF (4 мг/кг) статистически значимо увеличивает время жизни на высоте.

Таблица 1. Основные показатели устойчивости животных к острой гипобарической гипоксии

Особый интерес представляет исследование показателей устойчивости животных в группе GDNF (4 мг/кг). Несмотря на достоверное (р<0,05) увеличение времени жизни на высоте и коэффициента защиты в этой группе, время потери позы — показателя, характеризующего состояние рефлекторных реакций животных, оказалось наименьшим. Отмечено, что при увеличении концентрации глиального нейротрофического фактора устойчивость животных снижается. В группе с превентивным введением GDNF в дозе 40 мг/кг не выявлено статистически значимых различий в показателях устойчивости при сравнении со значениями контрольной группы.

Совместное применение нейротрофических факторов резко снижает показатели устойчивости животных к условиям острой нормобарической гипоксии. В этой группе отмечен самый низкий коэффициент защиты. Таким образом, установлен антагонистический эффект применения двух нейротрофических факторов.

Для оценки нейропротективных свойств BDNF и GDNF проведено изучение процессов сохранения пространственной памяти в водном лабиринте Морриса после эпизода острой гипобарической гипоксии. При обучении мышей в водном лабиринте были установлены основные стратегии поиска животными скрытой под водой платформы: 1) прямое достижение цели — животное непосредственно направлялось к месту расположения платформы (время достижения платформы составляло 3–10 с); 2) активный поиск — животное осуществляло циркулярные и радиальные поисковые движения, достигая цели в течение 10–20 с; 3) хаотичный поиск — отсутствие выраженной стратегии достижения цели, более 20 с; 4) отрицательный результат — животное не нашло платформу в течение попытки.

При первом помещении в водный лабиринт большинство особей выбирали хаотичный поиск цели. Животные плавали вдоль стенок бассейна, что объяснялось врожденной программой поведения — тигмотаксисом. При анализе последующих попыток у мышей наблюдались процессы формирования пространственной памяти. По мере обучения время нахождения животными платформы сокращалось, поиск цели становился направленным, как правило, характеризующимся циркулярными и радиальными движениями.

Через сутки после моделирования острой гипобарической гипоксии наблюдалось незначительное нарушение процессов воспроизведения долговременной памяти у мышей при отсроченном тестировании в водном лабиринте. Снижение оКс относительно значений в интактной группе было недостоверным (табл. 2). Применение Реамберина в качестве препарата с выраженными антигипоксическими свойствами не повлияло на процессы воспроизведения пространственной памяти после острой гипобарической гипоксии (оКс составил 25,6±3,1). Однако превентивное введение BDNF и GDNF предотвращало нарушение пространственной памяти в постгипоксическом периоде. Наилучшие результаты при отсроченном тестировании были получены в группах животных, которым интраназально вводили BDNF и GDNF в дозе 40 мкг/кг (оКс составил в группе BDNF, 40 мкг/кг — 35,5±4,1, в группе GDNF, 40 мкг/кг — 36,06±4,3). Интересно отметить, что оКс в обеих группах с превентивным введением BDNF и GDNF в дозе 40 мкг/кг был статистически значимо (р<0,05) выше показателей не только контрольной группы, но и группы сравнения. Применение нейротрофических факторов в малой дозировке (4 мг/кг) также способст­вовало снижению негативных эффектов гипоксии и сохранению следов пространственной памяти, однако обнаруженные тенденции не носят достоверный характер (оКс составил в группе BDNF, 4 мкг/кг — 30,6±3,9, а в группе GDNF, 4 мкг/кг — 33,54±3,98).

Таблица 2. Значения отсроченного коэффициента сохранения долговременной памяти у мышей после воздействия острой гипобарической гипоксии (М±m)

Обсуждение. Гипоксия — один из основных факторов поражения головного мозга при ишемии. Патологические реакции, запускаемые кислородным голоданием, связаны с разобщением окислительного фосфорилирования, нарушением энергетического обмена клетки, активацией свободно-радикальных процессов, стимуляцией апоптотических реакций. Особо губительно кислородное голодание сказывается именно на нервной системе, где потеря даже нескольких нейронов может вызвать необратимые нарушения в функционировании нейронных сетей. Возможность защиты клеток головного мозга от последствий кислородного голодания — одна из важнейших проблем современной нейробиологии и биомедицины.

Полученные нами в ходе экспериментов in vitro и in vivo результаты показывают, что нейротрофические факторы BDNF и GDNF обладают ярко выраженными антигипоксическими и нейропротективными свойствами. Превентивное их введение частично нивелирует негативные последствия гипоксии как на клеточном, так и на организменном уровнях.

Нейротрофический фактор головного мозга способен активно изменять метаболизм клеток нервной системы во взрослом организме. BDNF связывается с двумя типами мембранных рецепторов: с низкоаффинным рецептором к фактору NGF (low-affinity nerve growth factor receptor, LNGFR), или p75, и с высокоаффинным тирозинкиназным рецептором В — TrkB [18]. Можно предположить, что защитные механизмы BDNF обусловлены способностью зрелой молекулы белка связываться с рецептором TrkB и активировать внутриклеточные сигнальные каскады [7, 19]. Одним из сигнальных путей, повышающих выживаемость нервных клеток в условиях гипоксии, является активация белкового комплекса NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells). NF-kB1 отвечает за экспрессию антиапоптотических белков семейств Bcl2 и IAP (Inhibitors of Apoptosis) [20] и наряду с рядом других факторов (например, с-jun, cIAP1) служит основным тормозящим апоптоз агентом [21]. Увеличение синтеза мРНК NF-kB1 под влиянием BDNF рассматривается как один из возможных механизмов метаболической адаптации клетки к условиям кислородной депривации. Кроме того, антигипоксические эффекты BDNF могут быть обусловлены непосредственным действием данного нейротрофина на митохондриальную систему клетки. Исследование действия BDNF на метаболизм кислорода в митохондриях мозга показало, что BDNF концентрационно-зависимо повышает респираторный индекс (показатель эффективности дыхательной цепи, синтеза АТФ и целостности органелл) [22, 23]. Повышение респираторного индекса способствует адаптации клеток к условиям кислородного голодания.

Глиальный нейротрофический фактор головного мозга наряду с другими нейротрофинами участвует в процессах регуляции работы нейронных сетей во взрослом организме. Механизмы действия GDNF связаны с активацией сложных многокомпонентных нейрон–глиальных взаимодействий. Действие GDNF опосредовано активацией универсальных многокомпонентных рецепторов GFR1 [24]. Данный рецептор не имеет внутриклеточного домена, поэтому выполняет роль передатчика сигнала к другим белкам, в частности Ret-тирозинкиназы, которая в свою очередь активирует несколько внутриклеточных сигнальных каскадов: RAS/MAPK, фосфатидилинозитол-3 киназа (РК3-К)/Akt, фосфолипаза С [4, 5]. Активация RAS/MAPK, РК3-К/Akt сигнальных путей приводит к увеличению выживаемости различных популяций нейронов [5]. GDNF оказывает действие не только в месте синтеза, но и дистанционно [25, 26]. Поддержание функциональной активности нейронных сетей и устойчивости животных к условиям кислородного голодания может быть связано с активацией комплексных и универсальных GDNF-ассоциированных сигнальных систем. Таким образом, данный нейротрофин является уникальной сигнальной молекулой, не только обеспечивающей поддержание жизнеспособности отдельных нейронов, но и объединяющей метаболические реакции отдельных компонентов нейрон–глиальной сети в единую функциональную структуру.

Проведенные исследования показывают, что применение нейротрофических факторов BDNF, GDNF может существенно скорректировать отрицательные последствия гипоксического повреждения головного мозга.

Заключение. Нейротрофический фактор головного мозга и глиальный нейротрофический фактор обладают выраженными антигипоксическими и нейропротективными свойствами. Как показали эксперименты in vitro и in vivo, совместная аппликация GDNF и BDNF при гипоксическом воздействии менее эффективна, чем применение каждого из этих нейротрофических факторов по отдельности.

Финансирование исследования. Работа поддер­жана грантами РФФИ №13-04-01871, №13-04-12067, №14-04-31601, грантом (соглашение от 27 августа 2013 г. №02.В.49.21.0003 между Минобрнауки России и ННГУ), Федеральной целевой программой «Уникальная научная установка для исследования информационных процессов в головном мозге с использованием методов оптогенетики» (соглашение о предоставлении субсидии от 01.12.2014 № 14.591.21.0004).

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.