Новая версия метода ДНК-комет

Цель исследования — оценить возможность использования озона для создания индуцированных повреждений ДНК в индивидуальных клетках при их анализе с помощью метода ДНК-комет.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены на образцах цельной крови белых нелинейных интактных крыс-самцов (n=16) массой 250±25 г. Проведены две серии экспериментов по индукции повреждений ДНК в лейкоцитах на слайдах. В первой серии образцы подвергали воздействию гамма-излучения, во второй — слайды обрабатывали озонированным фосфатно-солевым буфером. Далее проводили лизис клеток, денатурацию ДНК, электрофорез, промывку, окрашивание ДНК SYBR GREEN I, флюоресцентную микроскопию и обработку изображений.

Результаты. Разработана новая версия метода ДНК-комет. Установлено, что концентрация озона в озоно-кислородной смеси 900 мкг/л и время воздействия 10 мин на клетки в слайдах оптимальны для детекции повреждений ДНК и их анализа, при этом применение озона позволяет минимизировать недостатки и ограничения использования с этой целью источника гамма-излучения.

1. Сирота Н.П., Кузнецова Е.А. Применение метода «комета тест» в радиобиологических исследованиях. Радиационная биология. Радиоэкология 2010; 50(3): 329–339.
2. Liao W., McNutt M.A., Zhu W.G. The comet assay: a sensitive method for detecting DNA damage in individual cells. Methods 2009; 48(1): 46–53, http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.02.016.
3. Пелевина И.И., Антощина М.М., Бондаренко В.А., Воробьева Н.Ю., Воронков Ю.И., Готлиб В.Я., Кудряшо­ва О.В., Осипов А.Н., Рябченко Н.И., Серебряный А.М., Цет­лин В.В. Индивидуальные цитогенетические и моле­ку­ляр­но-биологические особенности лимфоцитов крови лет­чиков и космонавтов. Радиационная биология. Ра­диоэкология 2007; 47(2): 141–150.
4. Хаймович Т.И., Нагиба В.И., Никанорова Е.А., Калиновская О.В., Иванов К.Ю., Паточка Г.Л. Репаративный статус и конформационное состояние хроматина клеток крови профессионалов-атомщиков, работавших с три­тием и его окисью. Экологический вестник 2010; 12(2): 84–94.
5. Газиев А.И. Низкая эффективность репарации кри­тических повреждений ДНК, вызываемых малыми дозами радиации. Радиационная биология. Радиоэкология 2011; 51(5): 512–529.
6. Osipov A.N., Smetanina N.M., Pustovalova M.V., Arkhangelskaya E., Klokov D. The formation of DNA single-strand breaks and alkali-labile sites in human blood lymphocytes exposed to 365-nm UVA radiation. Free Radic Biol Med 2014; 73: 34–40, http://dx.doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2014.04.027.
7. Hornhardt S., Rößler U., Sauter W., Rosenberger A., Illig T., Bickeböller H., Wichmann H.E., Gomolka M. Genetic factors in individual radiation sensitivity. DNA Repair (Amst) 2014; 16: 54–65, http://dx.doi.org/10.1016/j.dnarep.2014.02.001.
8. Котова Е.В., Сергиенко Т.Ф., Иванова М.А., Смоль­никова В.В., Глушен С.В., Меркулова И.П., Свирнов­­ский А.И. Влияние цисплатина на репарацию разрывов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека. Медицин­ский журнал 2006; 2(16): 1–5.
9. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изо­лированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений. М: Полиграф­сервис; 2006.
10. Ordzhonikidze K.G., Zanadvorova A.M., Abilev S.K. Organ specificity of the genotoxic effects of cyclophosphane and dioxidine: an alkaline comet assay study. Russian Journal of Genetics 2011; 47(6): 754–756, http://dx.doi.org/10.1134/s1022795411050127.
11. Recio L., Hobbs C., Caspary W., Witt K.L. Witt doze-response assessment of four genetoxic chemecals in a combined mouse and rat micronucleus and comet assay. Toxicol Sci 2010; 35(2): 149–162.
12. Braz M.G., Mazoti M.Á., Giacobino J., Braz L.G., Golim Mde A., Ferrasi A.C., de Carvalho L.R., Braz J.R., Salvadori D.M. Genotoxicity, cytotoxicity and gene expression in patients undergoing elective surgery under isoflurane anaesthesia. Mutagenesis 2011; 26(3): 415–420, http://dx.doi.org/10.1093/mutage/geq109.
13. Сорочинская У.Б., Михайленко В.М. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Онкология 2008; 10(3): 303–309.
14. García-Lestón J., Roma-Torres J., Vilares M., Pinto R., Prista J., Teixeira J.P., Mayan O., Conde J., Pingarilho M., Gaspar J.F., Pásaro E., Méndez J., Laffon B. Genotoxic effects of occupational exposure to lead and influence of polymorphisms in genes involved in lead toxicokinetics and in DNA repair. Environment International 2012; 43: 29–36, http://dx.doi.org/10.1016/j.envint.2012.03.001.
15. Pacini S., Giovannelli L., Gulisano M., Peruzzi B., Polli G., Boddi V., Ruggiero M., Bozzo C., Stomeo F., Fenu G., Pezzatini S., Pitozzi V., Dolara P. Association between atmospheric ozone levels and damage to human nasal mucosa in Florence, Italy. Environ Mol Mutagen 2003; 42(3): 127–135, http://dx.doi.org/10.1002/em.10188.
16. Faust F., Kassie F., Knasmüller S., Boedecker R.H., Mann M., Mersch-Sundermann V. The use of the alkaline comet assay with lymphocytes in human biomonitoring studies. Mutat Res 2004; 566(3): 209–229, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2003.09.007.
17. Szeto Y.T., Benzie I.F., Collins A.R., Choi S.W., Cheng C.Y., Yow C.M., Tse M.M. A buccal cell model comet assay: development and avaluation for human biomonitoring and nutritional studies. Mut Res 2005; 578(1–2): 371–381, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2005.06.014.
18. Dusinska M., Collins A.R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactionset. Mutagenesis 2008; 23(3): 191–205, http://dx.doi.org/10.1093/mutage/gen007.
19. Stcherbatyuk Т.G., Davydenko D.V., Novikova V.А. Oxidative stress level and anthropogenic load index as prognostic criteria of disease outcome in patients with oropharyngeal cancer. Sovremennye tehnologii v medicine 2013; 5(4): 25–32.
20. Скальский С.В., Ступакова Л.В., Роскошная Д.В., Турчанинов Д.В., Полещук Е.И., Охлопков В.А., Говору­ха Ю.С. Перспективы метода ДНК-комет в технологиях биомониторинга и оценки влияния окружающей среды на здоровье населения. Современные проблемы нау­ки и образования 2015; 3: 1–6.
21. Lee R.F., Steinert S. Use of single cell gel electrophoresis/comet assay for detecting DNA damage in aquatic (marine and freshwater) animals. Mutat Res 2003; 544(1): 43–64, http://dx.doi.org/10.1016/S1383-5742(03)00017-6.
22. Blasiak J., Arabski M., Krupa R., Wozniak K., Zadrozny M., Kasznicki J., Zurawska M., Drzewoski J. DNA damage and repair in type 2 diabetes mellitus. Mutat Res 2004; 554(1–2): 297–304, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2004.05.011.
23. Harangi M., Remenyik E.E., Seres I., Varga Z., Katona E., Paragh G. Determination of DNA damage induced by oxidative stress in hyperlipidemic patients. Mutat Res 2002; 513(1–2): 17–25, http://dx.doi.org/10.1016/S1383-5718(01)00285-6.
24. Demirbag R., Yilmaz R., Kocyigit A. Relationship between DNA damage, total antioxidant capacity and coronary artery disease. Mut Res 2005; 570(2): 197–203, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2004.11.003.
25. Sánchez P., Peñarroja R., Gallegos F., Bravo J.L., Rojas E., Benítez-Bribiesca L. DNA damage in peripheral lymphocytes of untreated breast cancer patients. Arch Med Res 2004; 35(6): 480–483, http://dx.doi.org/10.1016/j.arcmed.2004.11.008.
26. Sigurdson A.J., Hauptmann M., Alexander B.H., Doody M.M., Thomas C.B., Struewing J.P., Jones I.M. DNA damage among thyroid cancer and multiple cancer cases, controls, and long-lived individuals. Mutat Res 2005; 586(2): 173–188, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrgentox.2005.07.001.
27. Gamulin M., Garaj-Vrhovac V., Kopjar N. Evaluation of DNA damage in radiotherapy-treated cancer patients using the alkaline comet assay. Coll Antropol 2007; 31(3): 837–845.
28. Gamulin M., Kopjar N., Grgić M., Ramić S., Bisof V., Garaj-Vrhovac V. Genome damage in oropharyngeal cancer patients treated by radiotherapy. Croat Med J 2008; 49(4): 515–527, http://dx.doi.org/10.3325/cmj.2008.4.515.
29. Gamulin M., Garaj-Vrhovac V., Kopjar N., Ramić S., Viculin T., Juretić A., Grgić M. DNA and cytogenetic damage in white blood cells of postmenopausal breast cancer patients treated with radiotherapy. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng 2010; 45(3): 292–304, http://dx.doi.org/10.1080/10934520903467881.
30. Sánchez-Suárez P., Ostrosky-Wegman P., Gallegos-Hernández F., Peñarroja-Flores R., Toledo-García J., Bravo J.L., Del Castillo E.R., Benítez-Bribiesca L. DNA damage in peripheral blood lymphocytes in patients during combined chemotherapy for breast cancer. Mutat Res 2008; 640(1–2): 8–15, http://dx.doi.org/10.1016/j.mrfmmm.2007.11.008.
31. Taube S.E., Jacobson J.W., Lively T.G. Cancer diagnostics: decision criteria for marker utilization in the clinic. Am J Pharmacogenomics 2005; 5(6): 357–364, http://dx.doi.org/10.2165/00129785-200505060-00003.
32. McKenna D.J., McKeown S.R., McKelvey-Martin V.J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis 2008; 23(3): 183–190, http://dx.doi.org/10.1093/mutage/gem054.
33. Fikrová P., Štětina R., Hronek M., Hyšpler R., Tichá A., Zadák Z. Application of the comet assay method in clinical studies. Wien Klin Wochenschr 2011; 123(23–24): 693–699, http://dx.doi.org/10.1007/s00508-011-0066-0.
34. Тронов В.А., Гринько Е.В., Бериташвили Д.Р., Филиппович И.В. Микроэлектрофорез ДНК индивидуальных интактных и гамма-облученных тимоцитов. Цитология 1991; 33(2): 94–102.
35. Chaubey R.C., Bhilwade H.N., Rajagopalan R., Bannur S.V. Gamma ray induced DNA damage in human and mouse leucocytes measured by SCGE-Pro: a software developed for automated image analysis and data processing for Comet assay. Mutat Res 2001; 490(2): 187–197, http://dx.doi.org/10.1016/S1383-5718(00)00166-2.
36. Lankoff A., Bialczyk J., Dziga D., Carmichael W.W., Gradzka I., Lisowska H., Kuszewski T., Gozdz S., Piorun I., Wojcik A. The repair of gamma-radiation — induced DNA damage is inhibited by microcystin — LR, the PP1 and PP2A phosphatase inhibitor. Mutagenesis 2006; 21(1): 83–90, http://dx.doi.org/10.1093/mutage/gel002.
37. Vorob’eva Nlu., Antonenko A.V., Osipov A.N. Particularities of blood lymphocyte response to irradiation in vitro in breast cancer patients. Radiats Biol Radioecol 2011; 51(4): 451–456.
38. Требования радиационной безопасности при производстве, эксплуатации и выводе из эксплуатации (утилизации) медицинской техники, содержащей источники ионизирующего излучения. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ №91 от 07.07.2011.
39. Collins A.R. The comet assay: a heavenly method! Mutagenesis 2015; 30(1): 1–4, http://dx.doi.org/10.1093/mutage/geu079.
40. Speit G., Hartmann A. The comet assay: a sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage and repair. Methods Mol Biol 2006; 314: 275–286, http://dx.doi.org/10.1385/1-59259-973-7:275.
41. Степанов B.H. Методы и программные средства автоматизации анализа изображений медико-биологи­чес­ких микрообъектов. Автореф. дис. … канд. техн. наук. М; 2005.
42. Киселева Е.С., Голдобенко Г.В., Канаев С.В. и др. Лучевая терапия злокачественных опухолей. Под ред. Киселевой Е.С. М: Медицина; 1996; 464 с.
43. Ильин Л.А., Кириллов В.Ф., Коренков И.П. Ра­диа­ционная безопасность и защита. М: Медицина; 1996; 336 с.
44. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М: Слово; 2006; 556 с.
45. Viebahn-Hänsler R., León Fernández O.S., Fahmy Z. The low-dose ozone concept — guidelines and treatment strategies. Ozone: Science & Engineering Journal 2012; 34(6): 408–424.
46. Разумовский С.Д., Константинова М.Л., Грине­вич Т.В., Коровина Г.В., Зайцев В.Я. Брутто — закономерности разложения озона в физиологическом растворе и методика оценки количества озона, введенного больному вместе с дозой раствора. Биомедицинская химия 2010; 56(3): 380–386.
47. Тронов В.А., Никольская Т.А., Коноплянников М.А. ДНК-кометы как маркер клеточной гибели. Биофизика 1999; 44(2): 288–295.

Chernigina I.A., Shcherbatyuk T.G. A New Version of Comet Assay. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(1): 20, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.1.03