Новые флюоресцентные зонды для выявления амилоида

На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флюоресцентными зондами (тиофлавин Т и конго красный) осуществлен поиск веществ, перспективных в качестве флюоресцентных зондов, селективных к амилоиду в ряду производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло [5.2.11.7.02.6]дец-8-енов.

Сухие кристаллы выбранных веществ, имеющих подобное тиофлавину Т строение молекулярного ротора, при возбуждении ультрафиолетом излучали в видимом диапазоне 421,0–435,5 нм. Растворение веществ в 96º этаноле гасит свечение. Водно-спиртовые растворы этих веществ (0,75%; вода:этанол 96º=1:1; рН>7) также практически не излучали (за пределами чувствительности ФЭУ-39). Обработка обезличенных депарафинированных, предварительно окрашенных гематоксилином срезов почки человека с клинически и гистологически доказанным амилоидозом почки спиртовыми растворами исследуемых препаратов не сопровождалась выраженным свечением. Окраска срезов той же почки водно-спиртовыми ощелоченными растворами этих препаратов после заделки в нефлюоресцирующую прозрачную среду сопровождалась выраженным свечением в видимом диапазоне на длине волны 534 нм всех структур почки, с более интенсивным свечением амилоидных депозитов, чем клеточных структур.

Заключение. Полученный результат открывает хорошие перспективы использования исследованных веществ в качестве новых флюорофоров для выявления амилоида.

1. Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с ами­ло­идными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик кра­сителя. Автореф. дис. … докт. биол. наук. СПб; 2013.
2. Кузнецова И.М. Механизмы возникновения и свой­ст­ва промежуточных, неправильно свернутых и агре­ги­рованных форм белков. Автореф. дис. … докт. биол. наук. СПб; 2006.
3. Liu R., Su R., Qi W., He Z. Photo-induced inhibition of insulin amyloid fibrillation on online laser measurement. Biochem Biophys Res Commun 2011; 409(2): 229–234, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2011.04.132.
4. Ван Я., Кланк У.Э., Матис Ч.Э. мл. Производные тиофлавина, связывающие амилоид, способ обнаружения in vivo отложений амилоида и способ распознавания болезни Альцгеймера. Патент РФ 2324686 С2. 2008.
5. Фрeштль В., Сринивасачари Н., Ломанн С., Лопес-Де­бер М.-П., Мус А., Пильгрен-Бош М. Новые соединения для лечения заболеваний, связанных с амилоидом или амилоидподобными белками. Патент РФ 2469026 C2. 2012.
6. Козлов В.А., Митрасов Ю.Н., Кондратьева О.В., Гордеева И.В., Полякова О.Б., Груздев С.Е., Федорова М.Л., Борзова А.А. Острая токсичность 4-аза-1-гидроксиметил-10-окса-3,5-диоксо-4-фенилтрицикло[5,2,11,7,02,6]дец-8-ена. В кн.: Материалы 8-й международной научной школы «Наука и инновации — 2013». Йошкар-Ола; 2013; с. 264–265.
7. Козлов В.А., Сапожников С.П., Митрасов Ю.Н., Ав­руй­ская А.А., Карышев П.Б., Шептухина А.И., Нико­ла­ева О.В. Способ флуоресцентного гистологического вы­явления амилоида. Патент РФ 2611408. 2017.
8. Burns J., Pennock C.A., Stoward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. J Pathol Bacteriol 1967; 94(2): 337–344, https://doi.org/10.1002/path.1700940211.
9. Knowles T.P.J., Vendruscolo M., Dobson C.M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol 2014; 15(6): 384–396, https://doi.org/10.1038/nrm3810.
10. Krebs M.R., Bromley E.H., Donald A.M. The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. J Struct Biol 2005; 149(1): 30–37, https://doi.org/10.1016/j.jsb.2004.08.002.
11. Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of congo red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation. J Histochem Cytochem 1989; 37(8): 1273–1281, https://doi.org/10.1177/37.8.2666510.
12. Held P., Becker K. Analysis of α-synuclein fibril formation in vitro. Using fluorescence to monitor protein aggregation in microplates. Biotek; 2014. URL: http://www.biotek.com/resources/articles/analysis-of-synuclein-fibril-formation-in-vitro.html.
13. Baldwin A.J., Knowles T.P., Tartaglia G.G., Fitzpatrick A.W., Devlin G.L., Shammas S.L., Waudby C.A., Mossuto M.F., Meehan S., Gras S.L., Christodoulou J., Anthony-Cahill S.J., Barker P.D., Vendruscolo M., Dobson C.M. Metastability of native proteins and the phenomenon of amyloid formation. J Am Chem Soc 2011; 133(36): 14160–14163, https://doi.org/10.1021/ja2017703.

Sapozhnikov S.P., Karyshev P.B., Sheptukhina A.I., Nikolayeva O.V., Avruyskaya A.A., Mitrasov Y.N., Kozlov V.A. Novel Fluorescent Probes for Amyloid Detection. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(2): 91, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.2.11