Физико-химические свойства интравитреального имплантата на основе хитозана и полиэтилового спирта, насыщенного 5-фторурацилом

Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) представляет собой одну из тяжелейших форм заболеваний органа зрения и является серьезной медико-социальной проблемой. ПВР рассматривается как типовой патологический процесс внутри глаза, характеризующийся местным рубцеванием как средством ликвидации альтерации тканей, протекающий при таких офтальмологических заболеваниях, как отслойка сетчатки, гемофтальм, травма, диабет [1].

В структуре инвалидности по зрению ПВР составляет 2–9%, причем 84–89% страдающих этим заболеванием — лица трудоспособного возраста [2–4].

Пролиферативная витреоретинопатия требует комплексного хирургического лечения, осуществляемого зачастую в несколько этапов [5]. При отсутствии лечения слепота наступает в 100% случаев [6–8].

За последние годы достигнут прогресс в области хирургии отслойки сетчатки, что позволило снизить число интра- и послеоперационных ослож­нений, значительно повысить анатомические и функциональные результаты операций при данной патологии. Однако несмотря на качественно новый уровень современ­ных возможностей диагностики, значительный шаг вперед в сфере витреоретинальной хирургии, количество успешных операций, согласно данным многих авторов, достигает лишь 61,5–97,5% [9–13].

Прогрессирование ПВР в послеоперационном периоде является одной из главных причин неудачного хирургического лечения отслоек сетчатки и наблюдается в 2,2–29,4% случаев [9, 11, 13, 14]. Рецидивы отслойки сетчатки по причине прогрессирования ПВР составляют от 2,2 до 20,0% [11, 13, 15–17]. Поэтому продолжаются поиск и разработка новых методов лечения, позволяющих уменьшить травматичность операции и снизить риск возникновения операционных и послеоперационных осложнений.

На современном этапе наметились новые тенденции лечения ПВР — применение антипролиферативных агентов на различных носителях-имплантатах, используемых во время интравитреальных вмешательств. В последние годы возрастает интерес специалистов к использованию в качестве носителя полимерного материала хитозана, который полностью разрушается и усваивается организмом, обладает противовоспалительным и антипролиферативным действием, высокой биосовместимостью, улучшает процессы регенерации клеток и тканей [18–20]. В Казахском НИИ глазных болезней совместно с лабораторией синтеза полимеров Института химических наук им. А.Б. Бек­турова (Республика Казахстан) был разработан витреосинеретик Vitrenal, являющийся водным раствором полимера хитозана [6]. Проведенные клинические исследования подтвердили эффективность интравитреального введения Vitrenal в хирургическом лечении ПВР при отслойке сетчатки и травматических повреждениях глаза.

Одной из тенденций в витреоретинальной хирургии в настоящее время является использование препаратов, действие которых направлено на ингибицию формирования рубцовой ткани, в частности цитостатиков. Самый известный представитель этой группы — 5-фторурацил (5-ФУ) [21, 22]. Данный препарат является антиметаболитом, который ингибирует синтез ДНК и пролиферацию фибробластов. Однако разные авторы показывают неоднозначные результаты его применения, что обусловливает проведение дальнейших исследований возможностей препарата, в частности, в качестве покрытия хитозанового имплантата.

Цель исследования — оценить возможности использования интравитреального введения имплантата на основе хитозан-полимерной пленки, насыщенной 5-фторурацилом.

Материалы и методы. Исследованы физико-химические свойства полимерных имплантатов на основе хитозана и поливинилового спирта, насыщенных 5-ФУ в концентрациях 0,05 мл (250 мг/г) и 0,1 мл (500 мг/г), что соответствует 2,5 и 5,0 мг сухого вещества. Поливиниловый спирт использовали для улучшения физико-химических свойств пленок. Дозировка 5-ФУ была выбрана не случайно. В литературе 0,1–0,15 мл 5% 5-ФУ считается оптимальной терапевтической дозой. В исследовании Д.Н. Шариповой [21] при одномоментной интравитреальной инъекции 0,15 мл 5-ФУ в структурах глаза отмечены токсические изменения, которые отсутствуют при введении той же дозы на полиуретановом носителе. Нами выбрана терапевтическая дозировка (0,1 мл) и дозировка в 2 раза ниже терапевтической (0,05 мл) с учетом того, что имплантат (хитозан) сам по себе обладает антипролиферативным и противовоспалительным действием.

Снимки электронной сканирующей микроскопии (СЭМ) полимерных лекарственных форм получали на электрозондовом микроанализаторе Superprobe-733 (JEOL, Япония), снабженном энергодисперсионным спектрометром INCA Energy (Oxford Instruments, США). Порошок наносили на проводящую липкую ленту и затем для улучшения контраста изображения покрывали его тонким слоем золота в установке Fine Coat (JEOL, Япония). Съемку осуществляли в режиме вторичных электронов.

Для определения кинетики высвобождения 5-ФУ из хитозановой пленки применяли специальное устройство, состоящее из металлической корзинки, термостатируемого стакана и механической мешалки. Выход препаратов изучали в условиях in vitro. Для этого определенное количество хитозановых пленок помещали в металлическую корзинку, погруженную в 70 мл воды при комнатной температуре. Постоянную скорость перемешивания среды высвобождения (100 об./мин) обеспечивали с помощью магнитной мешалки, термостатирование поддерживали с помощью проточной ячейки. Через определенные промежутки времени 2 мл раствора отбирали для определения содержания лекарства методом УФ-спектроскопии.

Для определения способности имплантатов к стерилизации исследована их термоустойчивость методом термогравиметрического анализа на приборе TGA/SDTA 851 (Mettler Toledo, Швейцария).

С целью оценки возможности химического взаимодействия хитозана, поливинилового спирта и 5-ФУ были записаны и проанализированы инфракрасные спектры образцов перечисленных веществ. ИК-спектры регистрировали на спектрофотометре Nicolet 5700 FT-IR (Thermo Electron, США) с Фурье-преобразованием в области 4000–400 см^–1. Образцы готовили в виде таблеток с использованием кристаллов КВr.

Результаты и обсуждение

Сканирующая электронная микроскопия. На электрозондовом микроанализаторе Superprobe 733, снабженном энергодисперсионным спектромет­ром INCA Energy, произведена сканирующая электронная микроскопия хитозана и имплантата (рис. 1). Отчетливо видна гладкая поверхность хитозана, имплантат же обладает случайным распределением крупных структур с порами одинакового размера, составляющими 42,68 нм. Таким образом, имплантат имеет мезопоры.

---

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия хитозана (а) и имплантата, насыщенного 5-фторурацилом (б)

---

Высвобождение релиза 5-ФУ из имплантата. С целью определения пролонгирующих свойств исследовано высвобождение 5-ФУ из сшитых глютаральдегидом хитозан-поливиниловых пленок в условиях in vitro. Процесс высвобождения изучали методом УФ-спектроскопии по характеристическому максимуму поглощения препарата при λ=266 нм. Спектры детектировали на спектрофотометре JascoUV/VIS 7850 (JASCO International, Япония) в кварцевых кюветах толщиной 10 мм при 25^оС. Количество 5-ФУ определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности от концентрации. В качестве среды высвобождения применяли свежеприготовленный раствор Рингера–Локка.

Установлено, что процесс высвобождения препарата из системы состоит из трех основных стадий: 1) сорбция воды имплантатом и его набухание; 2) диффузия препарата в имплантате на границу раздела фаз «полимерная система–окружающая среда»; 3) диффузия препарата в объем растворителя.

Хитозановые пленки с 250 и 500 мг/г 5-ФУ были загружены в раствор для определения влияния дозы (концентрации) препарата на кинетику высвобождения. Отмечено, что изменение концентрации препарата в полимерной матрице не оказывает значительного влияния на процесс диффузии. 5-ФУ был практически полностью диффундирован в раствор Рингера–Локка в течение 60–70 ч (рис. 2). Полученные параметры высвобождения представлены в таблице.

---

Рис. 2. Выход 5-фторурацила из хитозан-поливиниловой пленки, сшитой глютаральдегидом, при концентрациях препарата 250 мг/г (1) и 500 мг/г (2)

---

Высвобождение 5-фторурацила из хитозан-поливиниловых пленок, сшитых глютаральдегидом, в растворе Рингера–Локка

---

Профиль кинетических кривых свидетельствует о том, что выход лекарства происходит согласно кинетике первого порядка и контролируется диффузией терапевтического агента в матрице.

Известно, что с увеличением толщины имплантата в 3 раза коэффициент диффузии препарата уменьшается приблизительно в 2 раза. Лимитирующую роль в процессе высвобождения 5-ФУ из хитозанового имплантата играет диффузия терапевтического агента в матрице, что подтверждается обратной зависимостью между скоростью высвобождения и толщиной пленки.

Изучение термоустойчивости хитозанового имплантата, насыщенного 5-ФУ. Термические свойства хитозанового имплантата изучали методом термогравиметрического анализа на приборе TGA/SDTA 851. Термогравиметрия — метод, позволяющий определить из­менение массы вещества при его контро­лируемой температурной обработке. Анализ проводили в интервале температур от 50 до 900^оС со скоростью нагрева 5^оС/мин (рис. 3).

---

Рис. 3. Термогравиметрический анализ хитозан-поливиниловой пленки с содержанием 5-фторурацила

---

Кривая термогравиметрического анализа хитозанового имплантата с 5-ФУ свидетельствует, что термическая деструкция имплантата начинается при температуре 250^оС. В целом процесс деструкции происходит в интервале температур 250–500^оС.

Полученные данные говорят о том, что имплантат на основе хитозана и поливинилового спирта, насыщенный 5-ФУ, может стерилизоваться в автоклаве.

Изучение взаимодействия химических групп хи­то­зана, поливинилового спирта и 5-ФУ. С целью оценки уровня взаимодействия химических групп сшитого глютаральдегидом хитозана, поливинилового спирта и 5-ФУ были записаны и проанализированы инфракрасные спектры образцов перечисленных веществ, которые регистрировали на спектрофотометре Nicolet 5700 FT-IR с Фурье-преобразованием в области 4000–400 см^–1. Образцы готовили в виде таблеток с использованием КВr.

На рис. 4 показаны инфракрасные спектры 5-ФУ, сшитой хитозановой пленки, содержащей 5-ФУ, и сшитой хитозан-поливиниловой пленки, содержащей 5-ФУ, соответственно. Основные пики 5-ФУ наблюдаются в спектре в области 3084 см^–1 (N–H), 1689 см^–1 (C=O), 1250 см^–1 (С=С) и 1180 см^–1 (C–F) (рис. 4, а).

---

Рис. 4. Инфракрасные спектры 5-ФУ (а), сшитой глютаральдегидом хитозановой пленки, содержащей 5-ФУ (б), и сшитой хитозан-поливиниловой пленки, содержащей 5-ФУ (в)

---

Абсорбция при 3127 см⁻¹ в хитозановой пленке, содержащей 5-ФУ, показала пики О–Н групп хитозана и N–H-валентные колебания 5-ФУ, которые накладываются друг на друга. С=О-колебания при 1683 см⁻¹ обнаружены в спектре хитозановой пленки, что также свидетельствует о наличии накладки.

Полосы поглощения 1247 см⁻¹ (C=C) и 1172 см⁻¹ (C–F-связь) обнаруживают наличие 5-ФУ в спектре пленки (рис. 4, б). О наличии азометиновой группы в продукте взаимодействия хитозана с глютаральдегидом следили по пику валентных колебаний связи C=N, который благодаря высокому коэффициенту экстинкции легко обнаруживается в приведенных спектрах на частоте 1634 см⁻¹. С увеличением числа протонированных аминогрупп в хитозане интенсивность этого пика возрастает.

Отмечены переход групп NH₂⁻ в группы –N=C⁻, исчезновение групп OH⁻ и образование ацетальных и простых эфирных групп при реакции OH⁻-групп с CH₂O.

Инфракрасные спектры хитозан-поливиниловой плен­ки, содержащей 5-ФУ, показаны на рисунке 4, в. Поглощение в области 3134 см⁻¹ свидетельствует о присутствии О–Н-группы хитозана, О–Н-группы поливинилового спирта и N–Н-связи 5-ФУ. В области 1664 см⁻¹ появляются полосы поглощения, вызванные участием C=O-связи в скелетных колебаниях молекулы поливинилового спирта в хитозан-поливиниловой пленке.

На рисунке также показано влияние глютаральдегида на химическую структуру хитозан-поливиниловой пленки. В области 1090 см⁻¹ обнаружено уменьшение OH- и C–O-связей поливинилового спирта, что свидетельствует о появлении –C–O–C-группы при 1090 см⁻¹.

Полученные данные доказывают, что 5-ФУ и полимеры совместимы. 5-ФУ в хитозане с поливиниловым спиртом химически не изменяется и, соответственно, не теряет своих фармакологических свойств.

Заключение. Использование интравитреального имплантата на основе природного полимера хитозана, насыщенного цитостатиком 5-фторурацилом, обеспечивает постепенное выделение 5-фторурацила в течение 60–70 ч, что снижает первичную пиковую концентрацию препарата и предотвращает превышение его терапевтической концентрации в окружающей среде. Установленные физико-химические свойства хитозанового имплантата, иммобилизованного 5-ФУ, свидетельствуют о возможности его использования в офтальмологии с целью пролонгирования действия препарата. Известные антипролиферативные и противовоспалительные свойства природного полисахарида хитозана подтверждают обоснованность его применения в качестве носителя лекарственного вещества.

Финансирование исследования. Данное исследование выполнено в рамках докторантуры по специальности «Медицина» (6D110100).

Благодарности. Авторы выражают свою благодарность администрации института химических наук им. А.Б. Бек­ту­рова и администрации Государственного медицинского университета г. Семей за помощь в проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.