Изучение биосовместимости ацеллюлярных матриксов легких приматов и возможностей их использования в качестве тканеинженерных конструкций

Е.В. Куевда, Е.А. Губарева, И.С. Гуменюк, Д.Д. Карал-оглы

Ключевые слова: ацеллюлярные матриксы; тканеинженерные конструкции; биосовместимость ацеллюлярных матриксов легких; детергент-энзиматическая децеллюляризация; рецеллюляризация.

2017, том 9, номер 4, стр. 82.

DOI: https://doi.org/10.17691/stm2017.9.4.10

Полный текст статьи

html pdf

2926

2015

Цель исследования — изучить биосовместимость ацеллюлярных матриксов на модели легких приматов, максимально приближенной по анатомо-морфологическим характеристикам к легким человека, для создания тканеинженерных конструкций.

Материалы и методы. Ацеллюлярный матрикс получен в результате детергент-энзиматической децеллюляризации легких приматов по модифицированному протоколу — увеличено время экспозиции и концентрация детергентов. Качество полученного каркаса оценивали морфологически после окрашивания гематоксилином и эозином и флюорофором DAPI, а также путем количественного определения резидуальной ДНК. Изменение состава децеллюляризированного внеклеточного матрикса исследовали количественно при регистрации площади позитивного окрашивания после проведения иммуногистохимического исследования и при окрашивании альциановым синим. Биосовместимость каркасов определяли с помощью XTT-тестов через 48 и 72 ч статической рецеллюляризации с последующей количественной оценкой. В качестве основного клеточного ресурса для заселения каркасов использовали мультипотентные мезенхимные стволовые клетки приматов, клеточную принадлежность которых верифицировали иммунофенотипированием и направленной дифференцировкой.

Результаты. Морфологическое исследование не выявило значительных структурных повреждений каркасов, остаточная ДНК составила 19,2%. Количественное определение площади положительного окрашивания выявило статистически значимое снижение содержания коллагена 1-го типа и фактора роста эндотелия сосудов — VEGF — после децеллюляризации. Отмечены количественные изменения состава внеклеточного матрикса, однако они не ухудшают биосовместимость каркасов и не влияют на клеточную активность.

Заключение. Полученные каркасы не обладают цитотоксическими свойствами, способствуют адгезии, росту и метаболической активности клеток, что позволяет считать ацеллюлярные матриксы перспективными для создания тканеинженерных конструкций легких после дополнительного улучшения белкового состава.

Ignatova G.L., Zakharova I.A., Sarsenbayeva A.S., Rodionova O.V., Grebneva I.V., Drozdov I.V., Blinova E.V., Minakina O.L., Antonov V.N., Belsner M.S., Pustovalova I.A. Features of chronic bronchitis in different age groups. International Journal of BioMedicine 2014; 4(1): 15–18.
Wagner D.E., Bonvillain R.W., Jensen T., Girard E.D., Bunnell B.A., Finck C.M., Hoffman A.M., Weiss D.J. Can stem cells be used to generate new lungs? Ex vivo lung bioengineering with decellularized whole lung scaffolds. Respirology 2013; 18(6): 895–891, https://doi.org/10.1111/resp.12102.
Sokocevic D., Bonenfant N.R., Wagner D.E., Borg Z.D., Lathrop M.J., Lam Y.W., Deng B., Desarno M.J., Ashikaga T., Loi R., Hoffman A.M., Weiss D.J. The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs. Biomaterials 2013; 34(13): 3256–3269, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.01.028.
Booth A.J., Hadley R., Cornett A.M., Dreffs A.A., Matthes S.A., Tsui J.L., Weiss K., Horowitz J.C., Fiore V.F., Barker T.H., Moore B.B., Martinez F.J., Niklason L.E., White E.S. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med 2012; 186(9): 866–876, https://doi.org/10.1164/rccm.201204-0754oc.
Bonenfant N.R., Sokocevic D., Wagner D.E., Borg Z.D., Lathrop M.J., Lam Y.W., Deng B., Desarno M.J., Ashikaga T., Loi R., Weiss D.J. The effects of storage and sterilization on decellularized and recellularized whole lung. Biomaterials 2013; 34(13): 3231–3245, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.01.031.
Куевда Е.В., Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гуменюк И.С., Гилевич И.В., Поляков И.С., Порханов В.А., Алексеенко С.Н., Маккиарини П. Опыт перфузионной рецеллюляризации биологического каркаса легких крысы. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2016; 18(1): 38–44, https://doi.org/10.15825/1995-1191-2016-1 -38-44
Wagner D.E., Bonenfant N.R., Sokocevic D., DeSarno M.J., Borg Z.D., Parsons C.S., Brooks E.M., Platz J.J., Khalpey Z.I., Hoganson D.M., Deng B., Lam Y.W., Oldinski R.A., Ashikaga T., Weiss D. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials 2014; 35(9): 2664–2679, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.11.078.
O’Neill J.D., Anfang R., Anandappa A., Costa J., Javidfar J., Wobma H.M., Singh G., Freytes D.O., Bacchetta M.D., Sonett J.R., Vunjak-Novakovic G. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg 2013; 96(3): 1046–1056, https://doi.org/10.1016/j.athoracsur.2013.04.022.
Куевда Е.В., Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В., Гуменюк И.С., Шаркова Т.В., Карал-оглы Д.Д., Орлов С.В., Маккиарини П. Децеллюляризация легких низших приматов: оптимизация протокола. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований 2015; 8: 244–247.
Badylak S.F., Taylor D., Uygun K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng 2011; 13: 27–53, https://doi.org/10.1146/annurev-bioeng-071910-124743.
Куевда Е.В., Губарева Е.А., Крашенинников С.В., Григорьев Т.Е., Гуменюк И.С., Сотниченко А.С., Гилевич И.В., Карал-оглы Д.Д., Орлов С.В., Чвалун С.Н., Редько А.Н., Алексеенко С.Н., Маккиарини П. Оценка влияния процесса децеллюляризации на изменение биомеханических свойств легких у приматов. Доклады Aкадемии наук 2016; 470(6): 724–727, https://doi.org/10.7868/s0869565216300289.
Ruifrok A.C., Johnston D.A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001; 23(4): 291–299.
Bonvillain R.W., Danchuk S., Sullivan D.E., Betancourt A.M., Semon J.A., Eagle M.E., Mayeux J.P., Gregory A.N., Wang G., Townley I.K., Borg Z.D., Weiss D.J., Bunnell B.A. A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A 2012; 18(23–24): 2437–2452, https://doi.org/10.1089/ten.tea.2011.0594.
Gilpin S.E., Guyette J.P., Gonzalez G., Ren X., Asara J.M., Mathisen D.J., Vacanti J.P., Ott H.C. Perfusion decellularization of human and porcine lungs: bringing the matrix to clinical scale. J Heart Lung Transplant 2014; 33(3): 298–308, https://doi.org/10.1016/j.healun.2013.10.030.
Nichols J.E., Niles J., Riddle M., Vargas G., Schilagard T., Ma L., Edward K., La Francesca S., Sakamoto J., Vega S., Ogadegbe M., Mlcak R., Deyo D., Woodson L., McQuitty C., Lick S., Beckles D., Melo E., Cortiella J. Production and assessment of decellularized pig and human lung scaffolds. Tissue Eng Part A 2013; 19(17–18): 2045–2062.