Метод ДНК-комет в оценке уровня повреждения ДНК лейкоцитов крови после фотодинамической терапии

Цель исследования — изучить методом ДНК-комет спонтанный уровень повреждений ДНК в лейкоцитах цельной крови животных-опухоленосителей после фотодинамической терапии (ФДТ) при локальном введении фотосенсибилизатора.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на 30 белых нелинейных крысах-самцах. В качестве модели неоплазии выбран штамм — карцинома почки крыс РА. Животные были разделены на три группы: интактные (n=10), без воздействия (n=10) и ФДТ (n=10), при этом в каждой группе выделены две подгруппы в зависимости от исходных объемов опухоли: А — менее 0,3 см³ и Б — более 0,5 см³.

При ФДТ интратуморально вводили 0,3% раствор препарата «Фотосенс» (ГНЦ «НИОПИК», Россия). Затем через 6–12 ч после инъекции в течение 10 мин воздействовали светодиодным лазером (λ=660±10 нм, P=100 мВт/см²). Всего было проведено 2 сеанса ФДТ на 15-е и 19-е сутки после перевивки.

Противоопухолевый эффект воздействия оценивали по коэффициенту абсолютного прироста опухоли.

Уровень повреждений ДНК определяли методом ДНК-комет в авторской модификации. Для оценки использовали параметр %ТДНК — содержание ДНК в «хвосте» кометы в процентах.

Результаты. Установлена прямая корреляционная зависимость между уровнем спонтанного повреждения ДНК и абсолютным коэффициентом прироста опухоли (коэффициент ранговой корреляции Спирменаr_s=0,85; p=0,006). После сеансов ФДТ методом ДНК-комет установлен повышенный спонтанный уровень повреждений ДНК в лейкоцитах цельной крови животных-опухоленосителей в подгруппе с исходными объемами карциномы почки до 0,3 см³ и не обнаружено таких изменений в подгруппе с исходными объемами более 0,5 см³. ФДТ при локальном введении препарата «Фотосенс» в 50% случаев приводила к регрессии карциномы почки при исходных объемах опухоли как менее 0,3 см³, так и более 0,5 см³. У резистентных к терапии крыс наблюдалась стимуляция опухолевого роста при исходных объемах опухоли до 0,3 см³.

Заключение. Спонтанный уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови, регистрируемый щелочной версией метода ДНК-комет в авторской модификации, можно использовать для косвенной оценки интенсивности роста злокачественного новообразования и прогноза ответа опухоли на фотодинамическую терапию с локальным введением фотосенсибилизатора.

1. Каплан М.А., Капинус В.Н., Попучиев В.В., Ро­ман­ко Ю.С., Ярославцева-Исаева Е.В., Спиченкова И.С., Шу­би­на А.М., Боргуль О.В., Горанская Е.В. Фото­дина­мическая терапия: результаты и перспективы. Радиация и риск (Бюл­летень НРЭР) 2013; 22(3): 115–123.
2. Gamayunov S.V., Grebenkina Е.V., Ermilina А.А., Karov V.А., König K., Korchagina К.S., Skrebtsova R.R., Terekhov V.M., Terentiev I.G., Turchin I.V., Shakhova N.М. Fluorescent monitoring of photodynamic therapy for skin cancer in clinical practice. Sovremennye tehnologii v medicine 2015; 7(2): 75–83, https://doi.org/10.17691/stm2015.7.2.10.
3. Fargnoli M.C., Peris K. Photodynamic therapy for basal cell carcinoma. Future Oncol 2015; 11(22): 2991–2996, https://doi.org/10.2217/fon.15.208.
4. Дуванский В.А., Князев М.В., Праведников П.В. Сов­ре­менные аспекты фотодинамической терапии заболе­ва­ний пищевода. Экспериментальная и клиническая гастро­энтерология 2011; 10: 111–116.
5. Yi E., Yang C.K., Leem C., Park Y., Chang J.E., Cho S., Jheon S. Clinical outcome of photodynamic therapy in esophageal squamous cell carcinoma. J Photochem Photobiol B 2014; 141: 20–25, https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2014.09.001.
6. Яицкий Н.А., Герасин В.А., Орлов С.В., Бутенко А.Б., Молодцова В.П., Деревянко А.В., Стельмах Л.В., Урте­нова М.А., Герасин А.В. Фотодинамическая терапия в ле­чении рака легкого. Вестник хирургии им. И.И. Гре­кова 2010; 169(5): 31–34.
7. Simone C.B. 2nd, Cengel K.A. Photodynamic therapy for lung cancer and malignant pleural mesothelioma. Semin Oncol 2014; 41(6): 820–830, https://doi.org/10.1053/j.seminoncol.2014.09.017.
8. Chen K.C., Hsieh Y.S., Tseng Y.F., Shieh M.J., Chen J.S., Lai H.S., Lee J.M. Pleural photodynamic therapy and surgery in lung cancer and thymoma patients with pleural spread. PLoS One 2015; 10(7): e0133230, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0133230.
9. Кубасова И.Ю., Вакуловская Е.Г., Ермакова К.В., Смир­нова З.С. Флюоресцентная диагностика и фото­дина­мическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга. Российский биотерапевтический журнал 2006; 5(4): 54–63.
10. Uzdensky A.B., Berezhnaya E., Kovaleva V., Neginskaya M., Rudkovskii M., Sharifulina S. Photodynamic therapy: a review of applications in neurooncology and neuropathology. J Biomed Opt 2015; 20(6): 61108, https://doi.org/10.1117/1.jbo.20.6.061108.
11. Трушина О.И., Чиссов В.И., Соколов В.В., Нови­кова Е.Г., Филоненко Е.В., Франк Г.А., Волченко Н.Н. Противовирусная и противоопухолевая эффективность фотодинамической терапии при предраке и раннем ра­ке шейки матки. Российский онкологический журнал 2009; 4: 15–18.
12. Hillemanns P., Garcia F., Petry K.U., Dvorak V., Sadovsky O., Iversen O.E., Einstein M.H. A randomized study of hexaminolevulinate photodynamic therapy in patients with cervical intraepithelial neoplasia 1/2. Am J Obstet Gynecol 2015; 212(4): 465.e1–465.e7, https://doi.org/10.1016/j.ajog.2014.10.1107.
13. Крикунова Л.И., Мкртчян Л.С., Каплан М.А., Ры­кова Е.В., Капинус В.Н. Возможности фотодинамической терапии рака вульвы. Радиация и риск (Бюллетень НРЭР) 2015; 24(2): 107–115.
14. Patel J., Rizk N., Kahaleh M. Role of photodynamic therapy and intraductal radiofrequency ablation in cholangiocarcinoma. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2015; 29(2): 309–318, https://doi.org/10.1016/j.bpg.2015.02.008.
15. Странадко Е.Ф., Титова В.А., Рябов М.В., Пет­ров­ский В.Ю. Фотодинамическая терапия как компо­нент комбинированного и комплексного лечения злокачест­венных опухолей головы и шеи. Альманах клинической медицины 2006; 12: 37.
16. Улупов М.Ю. Способ интерстициальной фотодина­мической терапии злокачественных опухолей головы и шеи. Российская оториноларингология 2010; 1(44): 137–140.
17. Полькин В.В., Каплан М.А., Медведев В.С., Cе­мин Д.Ю., Капинус В.Н., Спиченкова И.С., Исаев П.А., Дербугов Д.Н., Шубина А.М. Место фотодинамической тера­пии в программах органосохраняющего лечения плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта. Опухоли головы и шеи 2012; 1: 23–28.
18. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака — но­вый эффективный метод диагностики и лечения зло­ка­чественных опухолей. Соросовский образовательный журнал 1996; 8: 32–40.
19. Меерович И.Г., Меерович Г.А., Оборотова Н.А., Ба­рышников А.Ю. Распределение света по глубине опу­холевого очага и эффективность использования терапевтического излучения при фотодинамической терапии. Российский биотерапевтический журнал 2006; 5(3): 93–97.
20. Цыб А.Ф., Каплан М.А., Романко Ю.С., Попучиев В.В. Фотодинамическая терапия. М.: Медицинское информа­цион­ное агентство; 2009; 212 с.
21. Лагода Т.С., Каплан М.А., Кривошеев Я.В., Жаво­ронков Л.П., Бокова М.Б. Оптимизация схемы фото­дина­мической терапии саркомы М1 с применением Фотосенса. Вопросы онкологии 2000; 46(3): 327–331.
22. Ярославцева-Исаева Е.В., Каплан М.А., Роман­ко Ю.С., Сокол Н.И. Разработка методики фото­ди­на­мической терапии экспериментальной опухоли (саркома М1) при локальном введении фотосенсибилизатора. Российский биотерапевтический журнал 2003; 2(4): 19–22.
23. Лагода Т.С., Каплан М.А., Бондарь А.М., Бокова М.Б., Иванов Э.А., Бровин А.И., Спиченкова О.Н. Оптимизация фотодинамической терапии солидной саркомы М1 у крыс Вистар на примере применения препарата «Фотосенс». Вопросы онкологии 2005; 51(1): 103–107.
24. Bonnet R., Berenbaum M. Porphyrins as photosensitizers. In: Photosensitising compounds: their chemistry, biology and clinical use. Bock G., Harnett S. (editors). John Wiley & Sons, Chichester; 1989; p. 40–49.
25. Moan J., Berg K., Kvam E., Western A., Malik Z., Rock A., Schneckenburger H. Intracellular localization of photosensitizers. In: Ciba Foundation Symposium 146. Wiley, Chichester; 1989; p. 95–111.
26. Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues. J Photochem Photobiol B Biol 1990; 6: 343–347, https://doi.org/10.1016/1011-1344(90)85104-5.
27. McNair F.I., Marples B., West C.M., Moore J.V. A comet assay of DNA damage and repair in K562 cells after photodynamic therapy using haematoporphyrin derivative, methylene blue and meso-tetrahydroxyphenylchlorin. Br J Cancer 1997; 75(12): 1721–1729, https://doi.org/10.1038/bjc.1997.295.
28. Haylett A.K., Ward T.H., Moore J.V. DNA damage and repair in Gorlin syndrome and normal fibroblasts after aminolevulinic acid photodynamic therapy: a comet assay study. Photochem Photobiol 2003; 78(4): 337–341, https://doi.org/10.1562/0031-8655(2003)0780337:ddarig2.0.co;2.
29. Mozaffarieh M., Schötzau A., Josifova T., Flammer J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis 2009; 15: 1194–1199.
30. Экспериментальная оценка противоопухолевых пре­па­ратов в СССР и США. Под ред. Софьиной З.П., Сыр­кина А.Б., Голдина А., Кляйна А. М: Медицина; 1980; 295 с.
31. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М: Высшая школа; 1991; 399 с.
32. Chernigina I.A., Shcherbatyuk T.G. A new version of comet assay. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(1): 20–27, https://doi.org/10.17691/stm2016.8.1.03.
33. Степанов B.H. Методы и программные средства авто­матизации анализа изображений медико-биологи­чес­ких микрообъектов. Автореф. дис. … канд. техн. наук. М; 2005.
34. Сирота Н.П., Кузнецова Е.А. Применение метода «комета тест» в радиобиологических исследованиях. Радиационная биология. Радиоэкология 2010; 50(3): 329–339.

Chernigina I.A., Plekhanova E.S., Scherbatyuk T.G. The DNA Comet Assay for Evaluating Damage to Leukocyte DNA after Photodynamic Therapy. Sovremennye tehnologii v medicine 2017; 9(4): 89, https://doi.org/10.17691/stm2017.9.4.11