Восстановление морфологической структуры магистральных артерий с помощью периваскулярной имплантации сульфатированной формы хитозана при экспериментальном атеросклерозе

Атеросклероз считается одной из основных причин заболеваемости и смертности в высокоразвитых странах [1]. Весьма распространенной его клинико-морфологической формой является атеросклероз артерий нижних конечностей, приводящий к инвалидизации и ассоциирующийся с высоким риском смерти [1–5]. Разработка новых методов профилактики и лечения атеросклероза реализуется через управление процессом атерогенного воспаления. При этом особая роль в патогенезе атеросклероза отводится адвентиции [6, 7]. Она считается не менее важным компонентом сосудистой стенки, чем средний слой и интима, так как принимает участие в регуляции пролиферации гладкомышечных клеток среднего и внутреннего слоев сосуда при атерогенезе [8–11].

В настоящее время накопилось достаточное количество публикаций, демонстрирующих положительный эффект использования производных хитозана при лечении некоторых заболеваний, и в том числе атеросклероза, по причине высокой аффинности молекулы биополимера к липопротеинам низкой и очень низкой плотности. Однако холестеринснижающий эффект хитозана в многочисленных публикациях продемонстрирован при энтеральном введении биополимера или в стендовых исследованиях in vitro. В дополнение к этому эффекту различные по составу хитозансодержащие препараты стимулируют ангиогенез в ишемизированных тканях, что приводит к улучшению их кровоснабжения [12–14]. Однако проблема управления атерогенным воспалением в стенке магистральных артерий остается нерешенной, поскольку отсутствуют технологии прицельного подведения аффинных к холестерину биополимеров к зоне сегментарного поражения для одновременного запуска как механизма терапевтического ангиогенеза, так и механизма резорбции мягкой бляшки в подинтимном слое сосуда.

Оптимальным вариантом, предоставляющим возможности для полноценного изучения ранних признаков атерогенного воспаления в стенках сосудов, уже более ста лет считается холестериновая модель атеросклероза у экспериментальных животных. Использование холестериновой диеты у кроликов породы шиншилла в течение 80–110 сут обеспечивает существенное повышение в плазме крови уровня триглицеридов, холестерина, липопротеинов фракций ЛПНП и ЛПОНП, что сопряжено с высоким уровнем липидных фракций в стенках магистральных артерий [15, 16].

Цель исследования — демонстрация восстановления морфологической структуры магистральных артерий задних конечностей кроликов в модели атеросклероза путем периваскулярной имплантации сульфатированной формы хитозана.

Материалы и методы. Исследование проведено на 24 кроликах-самцах породы шиншилла массой 3,5±0,5 кг. При исследовании неукоснительно соблюдались этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Все манипуляции с животными проводили в соответствии с нормативами, указанными в руководстве «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, The National Academies Press)». Работа одобрена Этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого.

Половина животных в течение 110 сут получала стандартный рацион вивария. Другая половина — холестериновую диету с целью создания экспериментальной модели атерогенного воспаления. Диета включала следующий комплекс ингредиентов: 0,8 г холестерина на 1 кг массы тела кролика в нерафинированном подсолнечном растительном масле. Данную смесь кролики получали ежедневно на протяжении всего эксперимента, к воде доступ был свободный. Один раз в неделю в рацион добавлялись сырые овощи. На 80-е сутки эксперимента шесть кроликов, находившихся на холестериновой диете, и шесть кроликов, получавших стандартный рацион вивария, подвергали периваскулярной имплантации 1% геля сульфатированного водорастворимого хитозана (β1,4D-глюкопиранозид-N-метил-сульфанат натрия, мол. масса — 250 кДа, степень дезацетилирования — 85%).

Технология имплантации биополимера состояла в следующем: под общей анестезией кроликам на задней конечности в нижней трети голени в проекции магистрального сосудисто-нервного пучка производилось рассечение кожных покровов и подкожно-жировой клетчатки; в паравазальное фасциальное ложе артерии сафена с помощью шприца объемом 5 мл и одетой на него пластиковой канюли вводился в гелевой форме 1% сульфатированный водорастворимый хитозан в объеме 4 мл с расчетом на распространение продукта в ложе бедренной артерии до уровня паховой складки. Рану закрывали однорядными швами, накладывали асептическую марлевую повязку. Смену повязки осуществляли ежедневно с применением антибактериальных средств до полного заживления кожной раны.

Для исследования все кролики были разделены на 4 группы по 6 животных. Животные 1-й группы получали стандартный рацион вивария и служили группой интактного контроля. 2-я группа находилась на холестериновой диете и не получала имплантацию биополимера. Животные 3-й группы, получавшие обычный рацион вивария, подверглись имплантации сульфатированного хитозана объемом 4 мл в область периартериального фасциального футляра артерий левой задней конечности. 4-й группе животных, получавших холестериновую диету, идентично вводили хитозан.

Условия проведения эксперимента были одинаковыми для кроликов контрольной и опытных групп. Всех животных выводили из эксперимента на 110-е сутки. У всех проводили забор мягких тканей бедра и голени обеих задних конечностей, включающих магистральный сосудисто-нервный пучок, для выполнения гистологического исследования. Образцы тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин по общепринятой методике и изготавливали гистологические срезы толщиной 3–4 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. Микропрепараты подвергали обзорной микроскопии и морфометрическому исследованию с помощью программы JMicroVision v. 1.2.7. Количественная оценка включала определение толщины стенки бедренной артерии и артерии сафена, среднего диаметра и средней площади их просветов. Измерение каждого показателя производили в 5 срезах при увеличении 100. Микрофотографии получены с помощью микроскопа Axio Imager A1 c системой фотосъемки AxioCam MRc5 и программой Axio Vision (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 100, 200 и 400.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы SPSS20. Описательные статистики представлены абсолютными значениями и статистическими коэффициентами. Для оценки нормальности распределения использовали критерии Шапиро–Уилка (W) и Колмогорова–Смирнова. Для непараметрических учетных признаков описательные статистики представлены медианой и процентилями (Ме [25; 75]). Общее межгрупповое сравнение проводили по критерию Краскела–Уолисса, а затем попарное сравнение — по критерию Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты. При обзорной микроскопии стенки артерий интактных животных имеют обычное строение, равномерную толщину (рис. 1). Адвентиция образована рыхлой волокнистой соединительной тканью, которая без четких границ переходит в периваскулярную соединительную ткань, содержащую немногочисленные мелкие сосуды.

Рис. 1. Поперечный срез бедренной артерии интактного животного; ×200; окраска гематоксилином и эозином

Морфологические изменения в стенках артерий подопытных животных 2-й группы при экспериментальном моделировании атерогенного воспаления являются свидетельством его начальных стадий. На поперечных срезах сосудов интима имеет вид прерывистой выстилки, что обусловлено частичной деструкцией эндотелиоцитов (рис. 2). Сохранившиеся клетки эндотелия обладают неравномерно расположенными гиперхромными ядрами, выступающими в сосудистый просвет. Стенки сегментарно утолщены с формированием бляшек, основу которых составляют активно пролиферирующие фибробласты и гладкомышечные клетки субэндотелиальной оболочки. Ядра последних в этих местах располагаются в несколько рядов, перпендикулярно внутренней поверхности сосуда. Волокнистые структуры бляшки местами имеют рыхлый вид, что является свидетельством мукоидного отека. Интима лишена складчатости, внутренняя эластическая мембрана смещена в глубь сосудистой стенки. Средняя оболочка артерий под бляшкой истончена. В трех случайных наблюдениях в месте утолщения артериальной стенки отдельные миоциты средней оболочки имеют вакуолизированную, оптически пустую цитоплазму, что подтверждает их трансформацию в ксантомные клетки (рис. 3). Рыхлая волокнистая соединительная ткань адвентиции содержит располагающиеся небольшими группами неравномерно полнокровные узкие кровеносные сосуды.

Рис. 2. Экспериментальное атерогенное воспаление, сегментарное утолщение стенки бедренной артерии с формированием мягких бляшек (показаны стрелками), основу которых составляют активно пролиферирующие фибробласты и гладкомышечные клетки субэндотелиальной оболочки; ×200; окраска гематоксилином и эозином

Рис. 3. Экспериментальное атерогенное воспаление; ксантомные клетки в стенке артерии (показаны стрелками); ×200; окраска гематоксилином и эозином

Имплантация в периваскулярную клетчатку полисахаридного биополимера во всех случаях 3-й и 4-й групп сопровождается местной ответной тканевой реакцией. На момент выведения животных из эксперимента реакция имеет признаки хронического продуктивного воспаления вокруг инородных тел. Имплантированный биополимер в обеих группах подвергся частичной резорбции. Его небольшие депозиты рассеяны на участках различной площади. В местах их локализации определяются скопления макрофагов в виде разрозненных небольших групп, местами располагающихся по ходу межтканевых промежутков и в виде муфт вокруг нервных волокон и кровеносных сосудов. В составе макрофагальных инфильтратов присутствуют ксантомные клетки, имеющие полигональные очертания, небольшое гиперхромное ядро и слабо базофильную «пенистого» вида цитоплазму. Не меньшее представительство имеют гигантские многоядерные клетки, характеризующиеся интенсивно окрашенной амфофильной цитоплазмой, содержащей беспорядочно распределенные гиперхромные ядра вытянутой и округлой формы (рис. 4). В меньшем количестве, чем макрофаги, в инфильтратах присутствуют лимфоциты.

Рис. 4. Обилие гигантских многоядерных клеток в месте введения полисахаридного биополимера в периваскулярный слой (показано стрелками); ×200; окраска гематоксилином и эозином

Продуктивная макрофагальная тканевая реакция сопровождается появлением многочисленных мелких кровеносных сосудов, являющихся неотъемлемой частью очагов воспаления у животных обеих групп с имплантацией биополимера (рис. 5). Ксантомные и многоядерные клетки, активные макрофаги в большинстве наблюдений окаймляют по всей окружности бедренную артерию (рис. 6). В одном наблюдении макрофагальный инфильтрат контактирует снаружи с частью стенки артерии, которая в этом месте заметно истончена.

Рис. 5. Многочисленные мелкие сосуды в паравазальной клетчатке в зоне введения биополимера (показано стрелкой); в левой части снимка — продуктивное воспаление; ×100; окраска гематоксилином и эозином

Рис. 6. Макрофагальная реакция определяется в паравазальной клетчатке по всей окружности артерии в месте введения биополимера (показано стрелкой); ×100; окраска гематоксилином и эозином

Внешней границей артерий у кроликов обеих групп после имплантации служит наружная эластическая мембрана, имеющая вид слабоэозинофильной гомогенной структуры полосы, содержащая фиброцитоподобные, малодифференцированные клетки и мелкие вновь образованные кровеносные сосуды. Очертания наружной границы сосуда размыты. Гладкомышечные клетки в составе бляшек имеют ядра вытянутой формы, меньшую плотность распределения. Активное развитие сосудистой периваскулярной сети — отличительный признак наблюдений в группах животных с применением биополимера (рис. 7).

Рис. 7. Деградация биополимера (показано стрелкой), воспалительная реакция в адвентиции, активный неоангиогенез, равномерная, умеренная толщина стенки бедренной артерии кролика, получавшего холестериновую диету, после введения хитозана; ×200; окраска гематоксилином и эозином

В ходе морфометрического анализа срезов артерий бедра и голени кроликов установлено, что толщина сосудистой стенки артерии сафена голени интактных животных (1-я группа) статистически значимо меньше, чем у кроликов, которые в течение 110 сут получали холестериновую диету (2-я группа), и составляет 150,80 [130,38; 177,17] против 608,33 [545,38; 748,52] мкм (р<0,01). Однако у животных, содержавшихся на холестериновой диете (4-я группа), после имплантации 1% геля сульфатированного хитозана отмечается статистически значимое уменьшение толщины сосудистой стенки до 307,49 [257,48; 334,10] мкм (р<0,01). Толщина сосудистой стенки артерий кроликов, получавших стандартный рацион вивария (3-я группа), после имплантации составляет 251,22 [225,72; 274,74] мкм (р<0,01) (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительная характеристика толщины стенки бедренной артерии (интима + медиа) у исследуемых животных

Изменения среднего диаметра сосудистой стенки в группах имеют статистически значимый характер. Так, в интактной группе этот показатель составляет 214,35 [201,51; 246,64] мкм, а в группе животных, получавших холестериновую диету без имплантации биополимера, — 137,58 [124,38; 141,14] мкм (р<0,05). При имплантации 1% геля сульфатированного хитозана у кроликов, получавших холестериновую диету, отмечается статистически значимое увеличение среднего диаметра магистрального сосуда, которое составляет 163,39 [157,32; 170,83] мкм (р<0,05). У животных, находившихся на стандартном рационе вивария без имплантации биополимера, этот параметр отличается от показателя в контрольной группе менее значительно — 201,32 [189,26; 214,57] мкм (р<0,05).

Имплантация в паравазальное ложе 1% геля сульфатированного водорастворимого хитозана животным, находившимся на холестериновой диете, приводит к увеличению площади просвета дополнительных сосудов паравазального ложа по сравнению с группой животных, получавших холестериновую диету без имплантации полимера — 421,52 [409,89; 435,11] и 294,16 [280,67; 315,21] мкм соответственно (р<0,05).

Наряду с этим отмечается активация пролиферации коллатеральных сосудов рядом с артериальной магистралью после имплантации биополимера у животных на стандартной диете вивария, что влечет за собой улучшение перфузии мягких тканей и оценивается нами как положительный результат терапевтического ангиогенеза.

Обсуждение. Полученные результаты позволяют считать, что экспериментальное атерогенное воспаление в магистральных артериях кроликов морфологически проявляется в формировании типичной липидной («мягкой») бляшки, покрытой фиброзной оболочкой и приводящей к уменьшению диаметра просвета сосуда. В толще бляшки развиваются межуточный отек, пролиферация субинтимально и в медии гладких мио­цитов, возникают скопления ксантомных клеток. Эти изменения на 110-е сутки холестериновой диеты соответствуют стадии липоидоза и не противоречат ранее опубликованным данным [4, 7, 17, 18].

Морфологические изменения в стенках артерий, обусловленные имплантацией полисахаридного био­полимера, сводятся к снижению активности пролиферации гладкомышечных элементов, уменьшению отека и, соответственно, толщины артериальной стенки, что объективно подтверждается результатами морфометрии. В связи с тем, что адвентиция функционально сопряжена со средним и интимным слоями магистральных сосудов и активно включена в атерогенное воспаление, важно, чтобы адвентициальный и параадвентициальный слои заняли основное место при выполнении терапевтического вмешательства и доставки лекарственных средств, что позволит эффективно решать вопросы управления воспалительным процессом, включая атерогенез [10]. Кроме достижения эффекта терапевтического ангиогенеза, хитозановые сополимеры создают непосредственный контакт с атерогенными продуктами в субэндотелиальном пространстве магистральных артерий в силу электростатических, концентрационных и аффинных взаимодействий, а точнее, с холестеринсодержащими молекулами не только липидного ядра мягких бляшек, но и «пенистых» клеток интимного слоя. Эксперименты показали, что введение биополимеров в зоне адвентиции при открытом или закрытом хирургическом вмешательстве позволит уменьшить толщину интимы, будет тормозить рестеноз, отрицательное ремоделирование [9].

Таким образом, периваскулярное введение полисахаридного биополимера хитозана открывает перспективы для смещения центра атерогенного воспаления из субинтимальной в околоадвентициальную область, при этом большое значение будет иметь усиление неоангиогенеза в зоне воспаления вокруг инородного тела, что способствует лучшей оксигенации ишемизированных тканей. В то же время стимуляция ангиогенеза, сопровождающаяся активацией таких факторов, как эндотелиальный сосудистый фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (FGF), в итоге может вызвать пролиферацию эндотелия и формирование васкуляризированных атероматозных очагов, т.е. прогрессирование атерогенеза [19].

Заключение. Технология имплантации 1% геля сульфатированного водорастворимого хитозана в периваскулярный футляр магистральных артерий конечности при экспериментальном атеросклерозе позволяет достичь эффекта терапевтического паравазального ангиогенеза и снижения ранних признаков атерогенного воспаления. Это дает основания оценивать предложенный метод как перспективный при лечении хронической ишемии нижних конечностей, вызванной атеросклерозом. Механизмы, лежащие в основе торможения атерогенеза выраженным продуктивным пери- и параваскулярным воспалительным процессом, требуют детального морфологического и маркерного молекулярного анализа.

Финансирование исследования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, правительства Красноярского края, Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности в рамках научного проекта №16-44-240506.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.