Использование рецеллюляризированных нетканых материалов из полилактида, обогащенного коллагеном, для создания тканеинженерных конструкций диафрагмы

Цель исследования — изучить биосовместимость и биомеханические свойства рецеллюляризированных нетканых материалов на основе полилактида с добавлением коллагена в условиях in vitro и in vivo и оценить потенциальные возможности их использования для замещения дефектов диафрагмы в эксперименте на мелких лабораторных животных.

Материалы и методы. Нетканые материалы получали путем электроформования полилактида в герметичном коробе с последующим вакуумированием образцов. 9% водный раствор полилактида готовили в смеси растворителей: химически чистого хлороформа с 10% добавкой химически чистого этилового спирта. Микроволоконный материал обогащали коллагеном в весовой концентрации 0,1 и 0,5% с последующей заморозкой при –40°C или в жидком азоте. Структуру нетканых полилактидных матриксов оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии, а механические свойства — при проведении циклических испытаний для исследования прочностных и усталостных характеристик на разрывной машине. Полученные нетканые матриксы рецеллюляризировали мезенхимальными стромальными клетками в статических условиях. Качество полученных тканеинженерных конструкций оценивали морфологически при проведении рутинных гистологических исследований. Жизнеспособность клеток на каркасах и цитотоксические свойства матриксов определяли путем проведения XTT-тестов. Наименее токсичные образцы использовали для ортотопической имплантации крысам с последующим проведением морфологических исследований.

Результаты. Морфологический анализ и изучение жизнеспособности клеток на каркасах у образцов, подвергавшихся при формовании замораживанию в жидком азоте, выявили нецелесообразность их использования для проведения ортотопической трансплантации. Образцы, подвергавшиеся замораживанию в холодильной установке, продемонстрировали допустимые уровни цитотоксичности и были имплантированы. Морфологическое исследование после эксплантации указанных групп образцов не выявило значительного повреждения структуры и воспалительных изменений, однако имелись признаки выраженного спаечного процесса в области имплантации.

Заключение. Несмотря на способность нетканых матриксов усиливать фибринообразование, отсутствие цитотоксических свойств и выраженных реакций отторжения трансплантата позволяет считать нетканые полилактидные матриксы, подвергавшиеся при формовании замораживанию в холодильной установке при –40^°С, перспективными для создания тканеинженерных конструкций диафрагмы.

1. De Coppi P., Deprest J. Regenerative medicine solutions in congenital diaphragmatic hernia, seminars in pediatric surgery. Semin Pediatr Surg 2017; 26(3): 171–177, https://doi.org/10.1053/j.sempedsurg.2017.04.009.
2. De Coppi P. Regenerative medicine for congenital malformations. J Pediatr Surg 2013; 48(2): 273–280, https://doi.org/10.1016/j.jpedsurg.2012.11.005.
3. Gubareva E.A., Sjöqvist S., Gilevich I.V., Sotnichenko A.S., Kuevda E.V., Lim M.L., Feliu N., Lemon G., Danilenko K.A., Nakokhov R.Z., Gumenyuk I.S., Grigoriev T.E., Krasheninnikov S.V., Pokhotko A.G., Basov A.A., Dzhimak S.S., Gustafsson Y., Bautista G., Beltrán Rodríguez A., Pokrovsky V.M., Jungebluth P., Chvalun S.N., Holterman M.J., Taylor D.A., Macchiarini P. Orthotopic transplantation of a tissue engineered diaphragm in rats. Biomaterials 2016; 77: 320–335, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.11.020.
4. Romao R.L., Nasr A., Chiu P.P., Langer J.C. What is the best prosthetic material for patch repair of congenital diaphragmatic hernia? Comparison and meta-analysis of porcine small intestinal submucosa and polytetrafluoroethylene. J Pediatr Surg 2012; 47(8): 1496–1500, https://doi.org/10.1016/j.jpedsurg.2012.01.009.
5. Łukasiewicz A., Drewa T. Synthetic implants in hernia surgery. Adv Clin Exp Med 2014; 23(1): 135–142, https://doi.org/10.17219/acem/37037.
6. Ghanavati Z., Neisi N., Bayati V., Makvandi M. The influence of substrate topography and biomaterial substance on skin wound healing. Anat Cell Biol 2015; 48(4): 251–257, https://doi.org/10.5115/acb.2015.48.4.251.
7. Арутюнян И.В., Тенчурин Т.Х., Кананыхина Е.Ю., Черников В.П., Васюкова О.А., Ельчанинов А.В., Мака­ров А.В., Коршунов А.А., Буров А.А., Подуровская Ю.Л., Чупрынин В.Д., Уварова Е.В., Дегтярев Д.Н., Ше­пе­лев А.Д., Мамагулашвили В.Г., Камышинский Р.А., Кра­ше­нинников С.В., Чвалун С.Н., Фатхудинов Т.Х. Нетканые материалы на основе поликапролактона для тка­невой инженерии: выбор структуры и способа заселения. Гены и клетки 2017; 12(1): 62–71, https://doi.org/10.23868/201703009.
8. Zhao W., Ju Y.M., Christ G., Atala A., Yoo J.J., Lee S.J. Diaphragmatic muscle reconstruction with an aligned electrospun poly(ε-caprolactone)/collagen hybrid scaffold. Biomaterials 2013; 34(33): 8235–8240, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.07.057.
9. Pawar R.P., Tekale S.U., Shisodia S.U., Totre J.T., Domb A.J. Biomedical applications of poly(lactic acid). Recent Pat Regen Med 2014; 4(1): 40–51, https://doi.org/10.2174/2210296504666140402235024.
10. Hanson S., D’Souza R.N., Hematti P. Biomaterial-mesenchymal stem cell constructs for immunomodulation in composite tissue engineering. Tissue Eng Part A 2014; 20(15–16): 2162–2168, https://doi.org/10.1089/ten.tea.2013.0359.
11. Baker S.R., Banerjee S., Bonin K., Guthold M. Determining the mechanical properties of electrospun poly-ε-caprolactone (PCL) nanofibers using AFM and a novel fiber anchoring technique. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016; 59: 203–112, https://doi.org/10.1016/j.msec.2015.09.102.
12. Багаева В.В., Попова В.М., Пашкова Г.С., Исаджа­нян К.Е., Никитин В.В., Жиленков Е.Л. Изуче­ние эффективности и безопасности применения анти­микробных средств. Исследования и практика в медицине 2015; 2(3): 35–42, https://doi.org/10.17709/2409-2231-2015-2-3-35-42.
13. Yamanaka K., Yamamoto K., Sakai Y., Suda Y., Shigemitsu Y., Kaneko T., Kato K., Kumagai T., Kato Y. Seeding of mesenchymal stem cells into inner part of interconnected porous biodegradable scaffold by a new method with a filter paper. Dent Mater J 2015; 34(1): 78–85, https://doi.org/10.4012/dmj.2013-330.
14. Lv X.G., Feng C., Fu Q., Xie H., Wang Y., Huang J.W., Xie M.K., Atala A., Xu Y.M., Zhao W.X. Comparative study of different seeding methods based on a multilayer SIS scaffold: which is the optimal procedure for urethral tissue engineering? J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2016; 104(6): 1098–1108, https://doi.org/10.1002/jbm.b.33460.
15. Brouwer K.M., Daamen W.F., van Lochem N., Reijnen D., Wijnen R.M., van Kuppevelt T.H. Construction and in vivo evaluation of a dual layered collagenous scaffold with a radial pore structure for repair of the diaphragm. Acta Biomater 2013; 9(6): 6844–6851, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2013.03.003.
16. Urita Y., Komuro H., Chen G., Shinya M., Saihara R., Kaneko M. Evaluation of diaphragmatic hernia repair using PLGA mesh-collagen sponge hybrid scaffold: an experimental study in a rat model. Pediatr Surg Int 2008; 24(9): 1041–1045, https://doi.org/10.1007/s00383-008-2212-y.
17. Conconi M.T., De Coppi P., Bellini S., Zara G., Sabatti M., Marzaro M., Zanon G.F., Gamba P.G., Parnigotto P.P., Nussdorfer G.G. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineering approach to abdominal wall-defect repair. Biomaterials 2005; 26(15): 2567–2574, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2004.07.035.
18. Романова О.А., Григорьев Т.Е., Гончаров М.Е., Рудяк С.Г., Соловьева Е.В., Крашенинников С.В., Сапры­кин В.П., Сытина Е.В., Чвалун С.Н., Пальцев М.А., Панте­леев А.А. Хитозан как модифицирующий компонент искус­ственного матрикса в тканевой инженерии ко­жи человека. Клеточные технологии в биологии и ме­ди­цине 2015; 2: 103–113.

Kuevda E.V., Gubareva E.А., Grigoriev Т.E., Krasheninnikov S.V., Verevkin А.А., Lukanina K.I., Puzanov D.P., Yegiyev I.Kh., Vasiliev А.L., Chvalun S.N. Application of Recellularized Non-Woven Materials from Collagen-Enriched Polylactide for Creation of Tissue-Engineered Diaphragm Constructs. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(2): 35, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.2.05