Подход к выбору методов оценки качества биомедицинских клеточных продуктов, предназначенных для замещения дефектов кожи

Цель исследования — разработать подход к выбору методов оценки качества клеточного компонента биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), предназначенных для замещения дефектов кожи.

Материалы и методы. Исследованы БМКП-1 — дермальный эквивалент кожи (разработка Института биологии развития РАН) и БМКП-2 — эквивалент кожи (разработка Приволжского исследовательского медицинского университета). Клеточный компонент обоих БМКП — мезенхимальные стволовые клетки (МСК) жировой ткани человека.

Проводили подсчет и оценку жизнеспособности клеток в суспензии клеток и в структуре БМКП. Характеристики клеток в структуре БМКП без разрушения продукта определяли методами флюоресцентной микроскопии с использованием витальных красителей для окраски цитоплазмы и Hoechst 3334 (BD Pharmingen, США) — для ядер (имиджер Cytation 5; BioTek, США). Функциональную активность МСК оценивали по содержанию VEGF-А в ростовой среде методом ИФА. Фенотип МСК определяли методом цитометрии.

Результаты. С помощью предложенных методов было установлено, что МСК в БМКП сохраняют типичную морфологию и жизнеспособность. На поверхности БМКП-1 клетки распределяются в виде колоний, в структуре БМКП-2 — по всему объему матрицы. Количество клеток на БМКП-1 зависит от условий транспортировки, в структуре БМКП-2 — от сроков культивирования. Секреторная активность МСК сохраняется в течение всего периода наблюдения.

Экспрессия CD90 в процессе функционирования МСК в структуре обоих БМКП снижается и восстанавливается после выделения и культивирования клеток на пластике.

Заключение. Предложенный подход к выбору методов исследования позволил выявить специфические особенности оценки качества БМКП с учетом характеристики производства и условий транспортировки, связанных с клеточной природой продуктов и особенностями структуры неклеточного компонента. При отсутствии оптической проницаемости и при сложной структуре продукта предпочтительно выбирать методы контроля качества клеточного компонента, обеспечивающие минимальное манипулирование и повреждение агрессивными ферментами.

1. Пятигорская Н.В., Тулина М.А., Ала­дышева Ж.И., Бере­говых В.В. Меж­ду­народные подходы к регулиро­ва­нию препаратов клеточной терапии. Вестник Рос­сийской академии медицинских наук 2013; 68(8): 4–8.
2. Федеральный закон РФ от 23 июня 2016 г. №180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах».
3. Приказ Министерства здравоохранения Рос­сий­ской Федерации от 08.08.2018 г. №512н «Об утверж­де­нии Правил надлежащей практики по работе с био­ме­дицинскими клеточными продуктами».
4. Методические рекомендации по проведению до­кли­нических исследований биомедицинских клеточных про­дуктов. Под ред. Ткачука В.А. М: МГУ им. М.В. Ло­моносова; 2017; 302 с.
5. Егорихина М.Н., Левин Г.Я., Чарыкова И.Н., Алейник Д.Я., Соснина Л.Н. Способ создания биорезор­бируемого клеточного скаффолда на основе фибрина плазмы крови. Патент РФ 2653434. 2018.
6. Granero-Molto F., Weis J.A., Longobardi L., Spagnoli A. Role of mesenchymal stem cells in regenerative medicine: application to bone and cartilage repair. Expert Opin Biol Ther 2008; 8(3): 255–268, https://doi.org/10.1517/14712598.8.3.255.
7. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D.J., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315–317, https://doi.org/10.1080/14653240600855905.
8. Егорихина М.Н., Чарыкова И.Н., Алейник Д.Я. Спо­соб количественного анализа клеточной составляющей скаф­фолда. Патент РФ 2675376. 2018.
9. Ferrara N., Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev 1997; 18(1): 4–25, https://doi.org/10.1210/edrv.18.1.0287.
10. Nakagami H., Maeda K., Morishita R., Iguchi S., Nishikawa T., Takami Y., Kikuchi Y., Saito Y., Tamai K., Ogihara T., Kaneda Y. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005; 25(12): 2542–2547, https://doi.org/10.1161/01.atv.0000190701.92007.6d.
11. Rehman J., Traktuev D., Li J., Merfeld-Clauss S., Temm-Grove C.J., Bovenkerk J.E., Pell C.L., Johnstone B.H., Considine R.V., March K.L. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004; 109(10): 1292–1298, https://doi.org/10.1161/01.cir.0000121425.42966.f1.
12. Nasser M., Wu Y., Danaoui Y., Ghosh G. Engineering microenvironments towards harnessing pro-angiogenic potential of mesenchymal stem cells. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2019; 102: 75–84, https://doi.org/10.1016/j.msec.2019.04.030.
13. Reisbig N.A., Hussein H.A., Pinnell E., Bertone A.L. Evaluation of equine synovial-derived extracellular matrix scaffolds seeded with equine synovial-derived mesenchymal stem cells. Am J Vet Res 2018; 79(1): 124–133, https://doi.org/10.2460/ajvr.79.1.124.
14. Lee H.C., An S.G., Lee H.W., Park J.S., Cha K.S., Hong T.J., Park J.H., Lee S.Y., Kim S.P., Kim Y.D., Chung S.W., Bae Y.C., Shin Y.B., Kim J.I., Jung J.S. Safety and effect of adipose tissue-derived stem cell implantation in patients with critical limb ischemia: a pilot study. Circ J 2012; 76(7): 1750–1760, https://doi.org/10.1253/circj.cj-11-1135.
15. Wu S.C., Pollak R., Frykberg R.G., Zhou W., Karnoub M., Jankovic V., Fischkoff S.A., Chitkara D. Safety and efficacy of intramuscular human placenta-derived mesenchymal stromal-like cells (cenplacel [PDA-002]) in patients who have a diabetic foot ulcer with peripheral arterial disease. Int Wound J 2017; 14(5): 823–829, https://doi.org/10.1111/iwj.12715.

Aleynik D.Ya., Zagaynova E.V., Egorikhina M.N., Charykova I.N., Rogovaya O.S., Rubtsova Yu.P., Popova A.N., Vorotelyak E.A. Methods for Assessing the Quality of Biomedical Cell Products for Skin Replacement. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 34, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.4.04