Современные молекулярно-генетические технологии в изучении госпитальных штаммов

Цель исследования — оценить эффективность применения комплекса молекулярно-генетических методов: ПЦР, RAPD и MLST — с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии в изучении особенностей госпитальных штаммов.

Материалы и методы. Проведена идентификация 23 штаммов K. рneumoniae, выделенных в педиатрическом стационаре, с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Autoflex и программно-аппаратного комплекса MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия). Чувствительность к антибиотикам исследовали на автоматическом бактериологическом анализаторе Phoenix-100 (Becton Dickinson, США) с помощью хромогенных питательных сред ф. HiMedia (Индия). Поиск детерминант резистентности и молекулярное типирование штаммов проводили с использованием методов ПЦР, RAPD и MLST.

Результаты. Все исследуемые штаммы были идентифицированы как K. pneumoniae ssp. pneumoniae. Изучение чувствительности к антибиотикам позволило выделить три группы: 1-я группа (n=15) — чувствительные штаммы (wt); 2-я группа (n=7) — потенциальные производители карбапенемазы; 3-я группа (n=1) — производители бета-лактамаз расширенного спектра. У представителей 1-й и 2-й групп детерминант резистентности не выявлено, а у штамма из 3-й группы обнаружены бета-лактамазы bla_SHV и bla_СТХ-М. Были установлены RAPD-тип данного штамма, капсульный тип (К-23) и принадлежность его к 17-му сиквенс-типу. Штаммы с данным сиквенс-типом выделяются на территории Российской Федерации крайне редко, однако известны в Европе, США и странах Азии. Они связаны с тяжелыми и летальными патологиями человека и обладают высоким эпидемическим потенциалом.

Заключение. Применение комплекса современных технологий для изучения фенотипических и генотипических свойств микроорганизмов позволило выделить и охарактеризовать госпитальный штамм K. pneumoniae, обладающий антибиотикорезистентностью, которая обусловлена наличием бета-лактамаз bla_СТХ-М-15 и bla_SHV-11, и представляющий опасность в плане трансмиссивного распространения детерминант резистентности.

1. Lev A.I., Astashkin E.I., Kislichkina A.A., Solovieva E.V., Kombarova T.I., Korobova O.V., Ershova O.N., Alexandrova I.A., Malikov V.E., Bogun A.G., Borzilov A.I., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Fursova N.K. Comparative analysis of Klebsiella pneumoniae strains isolated in 2012–2016 that differ by antibiotic resistance genes and virulence genes profiles. Pathog Glob Health 2018; 112(3): 142–151, https://doi.org/10.1080/20477724.2018.1460949.
2. Бисекенова А.Л., Рамазанова Б.А., Мусаева А.А., Нурмолдин Ш.М., Алибаева Ж.С., Угышова Ш.Е. Анти­биотикорезистентность штаммов Enterobacteriaceae, вы­де­ленных от пациентов многопрофильных стациона­ров. Вестник Казахского Национального медицинского уни­верситета 2016; 4: 50–54.
3. Эйдельштейн М.В., Журавлев В.С., Шек Е.А. Рас­пространенность карбапенемаз среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в России. Известия Сара­товского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология 2017; 17(1): 36–41.
4. Angeletti S., Dicuonzo G., Lo Presti A., Cella E., Crea F., Avola A., Vitali M.A., Fagioni M., De Florio L. MALDI-TOF mass spectrometry and blakpc gene phylogenetic analysis of an outbreak of carbapenem-resistant K. pneumoniae strains. New Microbiol 2015; 38(4): 541–550.
5. Шипицына И.В., Розова Л.В. Оценка патогенного по­тенциала штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из ран больных хроническим остеомиелитом. Успехи совре­менного естествознания 2015; 4: 93–96.
6. Piperaki E.T., Syrogiannopoulos G.A., Tzouvelekis L.S., Daikos G.L. Klebsiella pneumoniae: virulence, biofilm and antimicrobial resistance. Pediatr Infect Dis J 2017; 36(10): 1002–1005, https://doi.org/10.1097/inf.0000000000001675.
7. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Скле­ено­ва Е.Ю., Иванчик Н.В., Тимохова А.В., Дехнич А.В., Козлов Р.С., Попов Д.А., Астанина М.А., Жданова О.А., Болышева Г.С., Новикова Р.И., Валиуллина И.Р., Кока­рева Т.С., Частоедова А.Н., Рог А.А., Поликарпова С.В., Гординская Н.А., Некаева Е.С., Абрамова Н.В., Доманская О.В., Землянская О.А., Горюнова Л.А., Скальский С.В., Елохина Е.В., Попова Л.Д., Божкова С.А., Гомон Ю.М., Кречикова О.И., Мищенко В.М., Рачина С.А., Стреж Ю.А., Гудкова Л.В., Колосова И.П., Вунукайнен Т.М., Ортенберг Э.А., Хохлявина Р.М., Портнягина У.С., Ша­маева С.Х., Матвеев А.С., Палютин Ш.Х., Власова А.В., Ершова М.Г., Лебедева М.С., Феоктистова Л.В., Гор­деева С.А., Долинина В.В., Чернявская Ю.Л., Ба­гин В.А., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. Анти­биотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011–2012 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2014; 16(4): 254–265.
8. Крыжановская О.А., Лазарева А.В., Алябьева Н.М., Тепаев Р.Ф., Карасева О.В., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Устойчивость к антибиотикам и молекулярные механизмы резистентности у карбапенем-нечувствительных изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных в педиатрических ОРИТ г. Москвы. Антибиотики и химиотерапия 2016; 61(7–8): 22–26.
9. Dubodelov D.V., Lubasovskaya L.A., Shubina E.S., Mukosey I.S., Korostin D.O., Kochetkova T.O., Bogacheva N.A., Bistritskiy A.A., Gordeev A.B., Trofimov D.Y., Priputnevich T.V., Zubkov V.V. Genetic determinants of resistance of hospital-associated strains of Klebsiella pneumoniae to β-lactam antibiotics isolated in neonates. Russian Journal of Genetics 2016; 52(9): 993–998, https://doi.org/10.1134/s1022795416090040.
10. Тапальский Д.В., Петренев Д.Р. Распространенность Klebsiella pneumoniae — продуцентов карбапенемаз в Бела­руси и их конкурентоспособность. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2017; 19(2): 139–144.
11. Gu D., Dong N., Zheng Z., Lin D., Huang M., Wang L., Chan E.W., Shu L., Yu J., Zhang R., Chen S. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect Dis 2018; 18(1): 37–46, https://doi.org/10.1016/s1473-3099(17)30489-9.
12. Zheng X., Wang J.F., Xu W.L., Xu J., Hu J. Clinical and molecular characteristics, risk factors and outcomes of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections in the intensive care unit. Antimicrob Resist Infect Control 2017; 6: 102, https://doi.org/10.1186/s13756-017-0256-2.
13. Лазарева И.В., Агеевец В.А., Ершова Т.А., Зуева Л.П., Гончаров А.Е., Дарьина М.Г., Светличная Ю.С., Усков А.Н., Сидоренко С.В. Распространение и антибактериальная резистентность грамотрицательных бактерий, продуцентов карбапенемаз в Санкт-Петербурге и некоторых других регионов Российской Федерации. Антибиотики и химиотерапия 2016; 61(11–12): 28–38.
14. Berrazeg M., Diene S.M., Drissi M., Kempf M., Richet H., Landraud L., Rolain J.M. Biotyping of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolates from France and Algeria using MALDI-TOF MS. PLoS One 2013; 8(4): e61428, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061428.
15. Lau A.F., Wang H., Weingarten R.A., Drake S.K., Suffredini A.F., Garfield M.K., Chen Y., Gucek M., Youn J.H., Stock F., Tso H., DeLeo J., Cimino J.J., Frank K.M., Dekker J.P. A rapid matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based method for single-plasmid tracking in an outbreak of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2014; 52(8): 2804–2812, https://doi.org/10.1128/jcm.00694-14.
16. Gaibani P., Galea A., Fagioni M., Ambretti S., Sambri V., Landini M.P. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of KPC-producing Klebsiella pneumoniae. J Clin Microbiol 2016; 54(10): 2609–2613, https://doi.org/10.1128/jcm.01242-16.
17. Gaibani P., Ambretti S., Tamburini M.V., Vecchio Nepita E., Re M.C. Clinical application of Bruker Biotyper MALDI-TOF/MS system for real-time identification of KPC production in Klebsiella pneumoniae clinical isolates. J Glob Antimicrob Resist 2018; 12: 169–170, https://doi.org/10.1016/j.jgar.2018.01.016.
18. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Карбапенемазы грамотрицательных бактерий: рас­про­стра­нение и методы детекции. Медицинский журнал 2012; 2(40): 10–15.
19. Afzali H., Firoozeh F., Amiri A., Moniri R., Zibaei M. Characterization of CTX-M-type extend-spectrum β-lactamase producing Klebsiella spp. in Kashan, Iran. Jundishapur J Microbiol 2015; 8(10): e27967, https://doi.org/10.5812/jjm.27967.
20. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Солнцев Л.А., Гординская Н.А. Молекулярное типирование клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия. Клини­чес­кая лабораторная диагностика 2017; 62(11): 699–704.
21. Коробова А.Г. Мониторинг энтеробактерий с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра, выде­ленных у больных гемобластозами при химиотерапии. Дис. … канд мед наук. М; 2018.
22. Ильина В.Н., Субботовская А.И., Козырева В.С., Сергеевичев Д.С., Шилова А.Н. Характеристика штаммов, продуцирующих БЛРС СТХ-М типа, выделенных в кардио­хирургическом стационаре. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2013; 15(4): 309–314.
23. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2000; 2(3): 82–95.
24. Асташкин Е.И., Лев А.И., Новикова Т.С., Карцев Н.Н., Федюкина Г.Н., Ершова М.Г., Полетаева Е.Д., Фурсова Н.К., Шепелин А.П. Характеристика антибиотикорезистентных клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных в Ярославле в 2016–2017 гг. Бактериология 2017; 2(3): 45.
25. Deschaght P., Van Simaey L., Decat E., Van Mechelen E., Brisse S., Vaneechoutte M. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA fragments (McRAPD). Res Microbiol 2011; 162(4): 386–392, https://doi.org/10.1016/j.resmic.2011.02.002.
26. Sachse S., Bresan S., Erhard M., Edel B., Pfister W., Saupe A., Rödel J. Comparison of multilocus sequence typing, RAPD, and MALDI-TOF mass spectrometry for typing of β-lactam-resistant Klebsiella pneumoniae strains. Diagn Microbiol Infect Dis 2014; 80(4): 267–271, https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2014.09.005.
27. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг в сис­теме эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Феде­­ральные клинические рекомендации. М; 2014.
28. Guo C., Yang X., Wu Y., Yang H., Han Y., Yang R., Hu L., Cui Y., Zhou D. MLST-based inference of genetic diversity and population structure of clinical Klebsiella pneumoniae, China. Sci Rep 2015; 5: 7612, https://doi.org/10.1038/srep07612.
29. Diancourt L., Passet V., Verhoef J., Grimont P.A., Brisse S. Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol 2005; 43(8): 4178–4182, https://doi.org/10.1128/jcm.43.8.4178-4182.2005.
30. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. Version 1.0, 2013. URL: http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST _files/Resistance_mechanisms/EUCAST_detection_ of_resistance_mechanisms_v1.0_20131211.pdf.
31. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., Il’ina E.N., Edelstein M.V., Govorun V.M. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods 2008; 75(3): 385–391, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2008.07.005.
32. Eftekhar F., Naseh Z. Extended-spectrum β-lactamase and carbapenemase production among burn and non-burn clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Iran J Microbiol 2015; 7(3): 144–149.
33. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 2014; 30(14): 2068–2069, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu153.
34. Brisse S., Passet V., Haugaard A.B., Babosan A., Kassis-Chikhani N., Struve C., Decré D. wzi Gene sequencing, a rapid method for determination of capsular type for Klebsiella strains. J Clin Microbiol 2013; 51(12): 4073–4078, https://doi.org/10.1128/jcm.01924-13.
35. Козлова Н.С., Баранцевич Н.Е., Баранцевич Е.П., Гоик В.Г. Устойчивость к антибиотикам клебсиелл различного происхождения. Инфекция и иммунитет 2016; 6(3): 48.
36. Bush K., Jacoby G.A. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54(3): 969–976, https://doi.org/10.1128/aac.01009-09.
37. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Кова­лев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Светоч Э.А., Сидоренко С.В. Генетическое окружение генов blaCTX-M, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003–2007 гг. Антибиотики и химиотерапия 2010; 55(11–12): 3–10.

Belova I.V., Tochilina А.G., Kovalishena О.V., Shirokova I.Y., Belyaeva Е.V., Poslova L.Y., Ermolina G.B., Solovyeva I.V. Current Molecular Genetic Technologies to Study Hospital Strains. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 126, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.4.15