Оценка возможности использования колониеформирующих эндотелиальных клеток для разработки тканеинженерных сосудистых графтов на основании анализа профиля генной экспрессии

Е.А. Великанова, М.Ю. Синицкий, А.В. Синицкая, В.Г. Матвеева, М.Ю. Ханова, Л.В. Антонова

Ключевые слова: колониеформирующие эндотелиальные клетки; мононуклеарная фракция периферической крови; эндотелиальные клетки коронарной артерии; генная экспрессия; тканевая инженерия.

2022, том 14, номер 3, стр. 15.

DOI: https://doi.org/10.17691/stm2022.14.3.02

Полный текст статьи

html pdf

809

946

Аннотация
Список литературы
Как цитировать в References

Цель исследования — оценка пригодности использования колониеформирующих эндотелиальных клеток для разработки тканеинженерных конструкций на основе изучения профиля генной экспрессии в сравнении со зрелыми эндотелиальными клетками.

Материалы и методы. Для эксперимента использовали колониеформирующие эндотелиальные клетки (endothelial colony-forming cells, ECFC), которые получали из периферической крови пациентов, перенесших чрескожное коронарное вмешательство. Клетки выделяли на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, США), затем культивировали в культуральной среде EGM-2MV (Lonza, Швейцария). В качестве контроля использовали коммерческую культуру первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (HCAEC). Клетки размораживали и культивировали согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications, США).

Эксперимент выполняли в специализированных планшетах µ-Luer в перфузионной системе (IBIDI, Германия), обеспечивающей непрерывный однонаправленный поток культуральной среды с напряжением сдвига 5 дин/см². Контрольные планшеты культивировали в стандартных условиях за аналогичный промежуток времени. Проводили выделение тотальной РНК из клеточных образцов. Экспрессию генов NOTCH4, NRP2, PLAT, PLAU, NOTCH1, FLT1, COL4A2, CD34, SERPINE1, HEY2, MKI67, KLF4, LYVE1, FLT4 оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции с детекцией результата в режиме реального времени. Экспрессию изучаемых генов рассчитывали по ΔCt-методу, выражали на логарифмической (log10) шкале в виде кратного изменения относительно контрольных образцов.

Результаты. У зрелых эндотелиальных клеток HCAEC под воздействием ламинарного потока статистически значимо увеличились только значения транскрипционного фактора KLF4 и маркера венозной дифференцировки NRP2. У ECFC наблюдали статистически значимое увеличение KLF4, NRP2, CD34 и LYVE1, а также уменьшение экспрессии PLAU. При этом отмечали гиперэкспрессию FLT4, LYVE1, NOTCH4 и NRP2 в ECFC по отношению к HCAEC и гипоэкспрессию HEY2. Также наблюдали характерную для прогениторных клеток гиперэкспрессию CD34. Характерной особенностью ECFC явилось увеличение экспрессии COL4A2, связанного с синтезом коллагена IV типа.

Заключение. Профиль генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток достаточно близок к таковому у первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека, следовательно, полученные из периферической крови пациентов клетки могут быть использованы при разработке персонифицированных тканеинженерных конструктов.

Mallis P., Kostakis A., Stavropoulos-Giokas C., Michalopoulos E. Future perspectives in small-diameter vascular graft engineering. Bioengineering (Basel) 2020; 7(4): 160, https://doi.org/10.3390/bioengineering7040160.
Paschalaki K.E., Randi A.M. Recent advances in endothelial colony forming cells toward their use in clinical translation. Front Med (Lausanne) 2018; 5: 295, https://doi.org/10.3389/fmed.2018.00295.
Prasain N., Lee M.R., Vemula S., Meador J.L., Yoshimoto M., Ferkowicz M.J., Fett A., Gupta M., Rapp B.M., Saadatzadeh M.R., Ginsberg M., Elemento O., Lee Y., Voytik-Harbin S.L., Chung H.M., Hong K.S., Reid E., O’Neill C.L., Medina R.J., Stitt A.W., Murphy M.P., Rafii S., Broxmeyer H.E., Yoder M.C. Differentiation of human pluripotent stem cells to cells similar to cord-blood endothelial colony-forming cells. Nat Biotechnol 2014; 32(11): 1151–1157, https://doi.org/10.1038/nbt.3048.
Yoder M.C., Mead L.E., Prater D., Krier T.R., Mroueh K.N., Li F., Krasich R., Temm C.J., Prchal J.T., Ingram D.A. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood 2007; 109(5): 1801–1809, https://doi.org/10.1182/blood-2006-08-043471.
Ren X., Feng Y., Guo J., Wang H., Li Q., Yang J., Hao X., Lv J., Ma N., Li W. Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications. Chem Soc Rev 2015; 44(15): 5680–5742, https://doi.org/10.1039/c4cs00483c.
Ingram D.A., Mead L.E., Tanaka H., Meade V., Fenoglio A., Mortell K., Pollok K., Ferkowicz M.J., Gilley D., Yoder M.C. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood 2004; 104(9): 2752–2760, https://doi.org/10.1182/blood-2004-04-1396.
Solomon I., O’Reilly M., Ionescu L., Alphonse R.S., Rajabali S., Zhong S., Vadivel A., Shelley W.C., Yoder M.C., Thébaud B. Functional differences between placental micro- and macrovascular endothelial colony-forming cells. Stem Cells Transl Med 2016; 5(3): 291–300, https://doi.org/10.5966/sctm.2014-0162.
Yu S., Li Z., Zhang W., Du Z., Liu K., Yang D., Gong S. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Exp Cell Res 2018; 370(1): 116–126, https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2018.06.013.
Alphonse R.S., Vadivel A., Zhong S., McConaghy S., Ohls R., Yoder M.C., Thébaud B. The isolation and culture of endothelial colony-forming cells from human and rat lungs. Nat Protoc 2015; 10(11): 1697–1708, https://doi.org/10.1038/nprot.2015.107.
Joo H.J., Song S., Seo H.R., Shin J.H., Choi S.C., Park J.H., Yu C.W., Hong S.J., Lim D.S. Human endothelial colony forming cells from adult peripheral blood have enhanced sprouting angiogenic potential through up-regulating VEGFR2 signaling. Int J Cardiol 2015; 197: 33–43, https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2015.06.013.
Nayak L., Lin Z., Jain M.K. “Go with the flow”: how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxid Redox Signal 2011; 15(5): 1449–1461, https://doi.org/10.1089/ars.2010.3647.
Kolbe M., Dohle E., Katerla D., Kirkpatrick C.J., Fuchs S. Enrichment of outgrowth endothelial cells in high and low colony-forming cultures from peripheral blood progenitors. Tissue Eng Part C Methods 2010; 16(5): 877–886, https://doi.org/10.1089/ten.tec.2009.0492.
Liu H., Gong X., Jing X., Ding X., Yao Y., Huang Y., Fan Y. Shear stress with appropriate time-step and amplification enhances endothelial cell retention on vascular grafts. J Tissue Eng Regen Med 2017; 11(11): 2965–2978, https://doi.org/10.1002/term.2196.
Melchiorri A.J., Bracaglia L.G., Kimerer L.K., Hibino N., Fisher J.P. In vitro endothelialization of biodegradable vascular grafts via endothelial progenitor cell seeding and maturation in a tubular perfusion system bioreactor. Tissue Eng Part C Methods 2016; 22(7): 663–670, https://doi.org/10.1089/ten.tec.2015.0562.
Fisher A.B., Chien S., Barakat A.I., Nerem R.M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 281(3): L529–L533, https://doi.org/10.1152/ajplung.2001.281.3.l529.
Dolan J.M., Sim F.J., Meng H., Kolega J. Endothelial cells express a unique transcriptional profile under very high wall shear stress known to induce expansive arterial remodeling. Am J Physiol Cell Physiol 2012; 302(8): C1109–C1118, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00369.2011.
Hale A.T., Tian H., Anih E., Recio F.O. III, Shatat M.A., Johnson T., Liao X., Ramirez-Bergeron D.L., Proweller A., Ishikawa M., Hamik A. Endothelial Krüppel-like factor 4 regulates angiogenesis and the notch signaling pathway. J Biol Chem 2014; 289(17): 12016–12028, https://doi.org/10.1074/jbc.m113.530956.
Egorova A.D., DeRuiter M.C., Boer H.C., Pas S., Gittenberger-de Groot A.C., Zonneveld A.J., Poelmann R.E., Hierck B.P. Endothelial colony-forming cells show a mature transcriptional response to shear stress. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2012; 48(1): 21–29, https://doi.org/10.1007/s11626-011-9470-z.
Cui X., Zhang X., Guan X., Li H., Li X., Lu H., Cheng M. Shear stress augments the endothelial cell differentiation marker expression in late EPCs by upregulating integrins. Biochem Biophys Res Commun 2012; 425(2): 419–425, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2012.07.115.
Tondreau M.Y., Laterreur V., Gauvin R., Vallières K., Bourget J.M., Lacroix D., Tremblay C., Germain L., Ruel J., Auger F.A. Mechanical properties of endothelialized fibroblast-derived vascular scaffolds stimulated in a bioreactor. Acta Biomater 2015; 18: 176–185, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2015.02.026.

Velikanova E.A., Sinitsky M.Yu., Sinitskaya А.V., Matveeva V.G., Khanova М.Yu., Antonova L.V. Evaluation of the Feasibility of Endothelial Colony-Forming Cells to Develop Tissue-Engineered Vascular Grafts Based on the Gene Expression Profile Analysis. Sovremennye tehnologii v medicine 2022; 14(3): 15, https://doi.org/10.17691/stm2022.14.3.02