Комбинированное введение оксида азота и водорода в экстракорпоральный контур искусственного кровообращения как метод органопротекции при операциях на сердце

Введение

При искусственном кровообращении (ИК) происходит активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран, где индуцирующую роль играют свободные радикалы кислорода. Продукты ПОЛ способны повреждать энергетический аппарат клетки, разобщать сопряженное с дыханием окислительное фосфорилирование, изменять активность мембраносвязанных ферментов, увеличивать проницаемость клеточных мембран, нарушать системы клеточной регуляции и клеточного деления, т.е. могут оказывать системное повреждающее воздействие на клетку [1–3].

Известно, что кислород в клетке утилизируется двумя путями — оксидазным и оксигеназным. В первом случае кислород восстанавливается до молекулы воды на дыхательных цепях митохондрий, во втором — образует свободные радикалы кислорода (СРК), которые чрезвычайно активны, способны повреждать клеточные структуры как непосредственно, так и опосредованно через активацию процессов ПОЛ. В ответ на любое экстремальное воздействие (например, хирургическое вмешательство) организм сначала реагирует увеличением интенсивности обмена веществ, способствующим адаптации к новым условиям. Если нагрузка превышает возможности защиты, то происходит срыв с развитием так называемого окислительного стресса. При невозможности организма нивелировать образовавшиеся СРК происходит окислительное повреждение органов и тканей [4, 5].

Обширное хирургическое вмешательство, при котором нарушаются нормальное потребление кислорода и образование энергии, обусловливает возникновение и развитие каскада патофизиологических реакций, основой которого является изменение процессов свободнорадикального окисления, т.е. происходит сдвиг динамического равновесия в сторону стимуляции образования СРК и накопления недоокисленных токсичных продуктов, способствующих усилению повреждающего действия [6].

Интенсификация свободнорадикальных процессов играет важную роль в патогенезе внутриорганных повреждений при операциях в условиях ИК. В ходе хирургического вмешательства ткани подвергаются гипоксии и реоксигенации, что вызывает активацию процессов ПОЛ и изменение антиоксидантных свойств крови [7]. Вызываемые усиленной генерацией СРК окислительные повреждения мембран занимают важное место среди ишемических и реперфузионных осложнений, оказывают существенное влияние на исход операции и могут возникать как сразу после ИК, так и в раннем послеоперационном периоде [8].

Оксид азота обладает антиоксидантным действием, проявляющимся в ингибировании оксидативных реакций, увеличении активности антиоксидантных ферментов и экспрессии кодирующих их генов. Оксид азота может замедлять перекисное окисление липидов, действуя как скавенджер кислородных радикалов. Поэтому взаимодействие между супероксид-анионом и оксидом азота может быть биологически важным путем детоксикации потенциально опасных активных форм кислорода [9]. Кроме того, известно, что молекулярный водород связывает свободные радикалы гидроксила и пероксинитрита. Воздействие этих радикалов на критически важные биомолекулы нуклеиновых кислот, липопротеинов мембран клеток и клеточных органелл приводит к повреждению миокарда при операциях с ИК [10]. В настоящее время в литературе отсутствуют клинические исследования, посвященные комбинированному применению оксида азота и водорода при операциях с ИК, что и определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования — изучить влияние комбинированного введения оксида азота и водорода в экстракорпоральный контур при искусственном кровообращении на антиоксидантную активность и органные повреждения при кардиохирургических вмешательствах.

Материалы и методы

Проведен анализ течения интра- и послеоперационного периодов у 91 пациента, которым были выполнены операции на сердце в условиях ИК (операции на клапанах сердца, аортокоронарное шунтирование + коррекция клапанной патологии). Исследование одобрено Этическим комитетом НИИ Специализированная кардиохирургическая клиническая больница им. академика Б.А. Королева и проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации (2013). От каждого пациента получено информированное согласие.

Больные рандомизированы по случайному принципу на 3 группы: 1-я группа (контрольная) — 30 пациентов; 2-я группа — 33 пациента, которым проводили изолированную подачу оксида азота (40 ppm) в экстракорпоральный контур в ходе ИК; 3-я группа — 28 больных, которым выполняли комбинированную подачу оксида азота (40 ppm) и водорода (1,2 ppm) в экстракорпоральный контур в ходе ИК. Характеристика пациентов представлена в табл. 1. Статистически значимых различий между группами по полу, возрасту и тяжести состояния не выявлено (p>0,05).

---

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

---

Всем пациентам выполнены оперативные вмешательства на клапанах сердца или сочетанные операции на клапанах и коронарных артериях сердца. Все операции проводили в условиях нормотермического ИК, а с целью защиты миокарда использовали комбинированную кристаллоидную фармакохолодовую кардиоплегию раствором Custadiol (Германия). Длительность ИК (среднее значение ± стандартное отклонение, М±SD) составила в 1-й группе 100,30±30,25 мин; во 2-й группе — 124,60±39,90 мин; в 3-й группе — 117,40±45,05 мин; время пережатия аорты составило 75,6±23,1; 93,1±31,9 и 89,3±31,8 мин соответственно. Статистически значимых различий между группами не выявлено.

У пациентов 1-й группы (контроль) ИК проводили по протоколу, принятому в НИИ Специализированная кардиохирургическая клиническая больница им. академика Б.А. Королева. У пациентов 2-й группы осуществляли подачу газообразного оксида азота (40 ppm) в линию доставки газов в оксигенатор аппарата искусственного кровообращения (АИК). В качестве генератора газообразного оксида азота использовали аппарат «Тианокс» (НПЦФ РФЯЦ-ВНИИЭФ, Россия); дозирование оксида азота осуществляли с помощью встроенного монитора генерирующего устройства. Подачу оксида азота в контур ИК начинали с момента выхода на расчетную производительность перфузии и продолжали до момента окончания ИК. Пациентам 3-й группы осуществляли комбинированную подачу газо­образного оксида азота (40 ppm) и молекулярного водорода (1,2 ppm) в линию доставки газов в оксигенатор АИК. В качестве генератора газообразного оксида азота использовали аппарат «Тианокс», а в качестве генератора водорода — аппарат BozonH2/O3 UV control (Econica Medical Engineering, Украина). Дозирование газов осуществляли с помощью встроенных мониторов генерирующих их устройств. Схема подключения подачи газов в экстракорпоральный контур представлена на рисунке.

---

Схема комбинированного подключения генератора оксида азота и генератора молекулярного водорода АИК — аппарат искусственного кровообращения

---

После достижения расчетной объемной скорости перфузии осуществляли подачу оксида азота в дозе 40 ppm и водорода в дозе 1,2 ppm в контур экстракорпоральной циркуляции. Данный протокол подачи оксида азота и водорода сохраняли на протяжении всего периода проведения ИК. Подачу газов в контур экстракорпоральной циркуляции прекращали после восстановления эффективной сердечной деятельности за 5 мин до окончания ИК.

Исследовали интенсивность процессов ПОЛ по содержанию диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), оснований Шиффа (ОШ) в плазме крови; также определяли агрегацию эритроцитов. Исследования включали несколько этапов: 1 — исходный, после индукции в наркоз; 2 — перед ИК; 3 — через 5 мин после начала ИК; 4 — на 30-й минуте ИК; 5 — на 60-й минуте ИК; 6 — на 90-й минуте ИК; 7 — по окончании ИК; 8 — по окончании операции. Содержание ДК и ТК, ОШ в плазме крови определяли методом И.А. Волчегорского (1989). К плазме добавляли гептан-изопропанольную смесь (1:1), встряхивали, затем вносили 1 мл водного раствора соляной кислоты (pH₂) и 2 мл гептана. После отстаивания и расслоения полученной смеси на фазы производили замер оптических плотностей (Е) на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия), оценивая каждую фазу при длинах волн 220 нм (поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278 нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). В процессе исследования сохранность эритроцитов у больных 2-й и 3-й групп оценивали по агрегационным свойствам эритроцитов. Агрегацию эритроцитов изучали методом оптической микроскопии путем подсчета одиночных эритроцитов и их агрегатов [11]. В качестве стимулятора агрегации использовали раствор голубого декстрана Т-2000 в дозе 20 мг/мл (GE HealthCare, США) в Трис-НСl-буфере (рН=7,4). Отмытые эритроциты разводили раствором декстрана (в соотношении 1:10 по объему) и в камере Горяева подсчитывали число неагрегированных эритроцитов. Общее число эритроцитов в пробе считали в изотоническом растворе NaCl. Уровень агрегации (А) рассчитывали по формуле:

А=100% – (число свободных (неагрегированных) эритроцитов × общее число эритроцитов^–1 × 100%).

Кроме этого в качестве клинического показателя исследовали течение послеоперационного периода.

Статистический анализ проводили при помощи программ Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0. Расчет точного критерия Фишера для анализа четырехпольных таблиц выполняли онлайн на сайте https://medstatistic.ru/. Характер распределения данных оценивали с помощью тестов Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка, так как данные тесты дают в основном сходные, но нередко различающиеся статистики. Для статистического анализа данных, соответствующих закону о нормальном распределении, использовали дисперсионный анализ (ANOVA) и критерий Даннета, учитывающий эффект множественных сравнений с контрольной группой [12]. Результаты всех тестов считали статистически значимыми при значении р<0,05.

Результаты

Динамика уровня ДК во время операции представлена в табл. 2. У пациентов 1-й группы отсутствовали статистически значимые изменения данного показателя на доперфузионном этапе операции и наблюдалось статистически значимое его возрастание на 90-й минуте ИК (1,093±0,573 отн. ед.) с дальнейшим снижением к концу операции (0,336±0,041 отн. ед.). Динамика уровня ДК во 2-й группе также отражала отсутствие статистически значимых изменений на всех этапах операции по сравнению с исходным показателем. Необходимо отметить, что уровень ДК у пациентов 2-й группы на 90-й минуте ИК был в три раза ниже по сравнению с пациентами 1-й группы. Динамика уровня ДК у пациентов 3-й группы отражала отсутствие статистически значимых изменений на доперфузионном этапе операции, а также плавное снижение этого показателя перед ИК (0,257±0,043 отн. ед.) и в конце операции (0,208±0,050 отн. ед.). Содержание ДК на 90-й минуте ИК было статистически значимо ниже у больных 3-й группы по сравнению с 1-й группой.

---

Таблица 2. Динамика содержания диеновых конъюгатов у больных, отн. ед. (M±SD)

---

Динамика уровня ТК во время операции представлена в табл. 3. У пациентов 1-й группы отсутствовали статистически значимые изменения данного показателя на доперфузионном этапе операции и наблюдалось статистически значимое его возрастание (с 0,091±0,013 до 0,334±0,114 отн. ед.) на 90-й минуте ИК с дальнейшим снижением к концу операции (до 0,143±0,092 отн. ед.). Динамика уровня ТК у пациентов 2-й группы отражала отсутствие статистически значимых изменений параметра в ходе операции: так, его концентрация перед ИК составляла 0,128±0,056 отн. ед., к 90-й минуте ИК наблюдалось возрастание до 0,131±0,044 отн. ед. и возвращение к исходным значениям в конце операции — 0,080±0,015 отн. ед. Необходимо отметить, что уровень ТК на 90-й минуте ИК у пациентов 2-й группы был статистически значимо ниже по сравнению с 1-й группой. Уровень ТК на 30-й минуте у пациентов 3-й группы был статистически значимо выше, чем в 1-й группе, однако к 90-й минуте ИК отмечалось статистически значимое снижение этого показателя (0,110±0,020 отн. ед.) по сравнению с 1-й группой.

---

Таблица 3. Динамика содержания триеновых конъюгатов у больных, отн. ед. (M±SD)

---

Динамика уровня ОШ во время операции представлена в табл. 4. У пациентов 1-й группы отсутствовали статистически значимые изменения данного показателя на доперфузионном этапе операции и отмечалось статистически значимое его возрастание (с 15,190±4,715 отн. ед. до 33,324±15,640 отн. ед.) на 90-й минуте ИК с дальнейшим снижением к концу операции (до 8,204±1,948 отн. ед.). Динамика уровня ОШ у пациентов 2-й группы характеризовалась отсутствием статистически значимых изменений данного показателя на протяжении всей операции. При этом на 90-й минуте ИК уровень ОШ был статистически значимо ниже (11,483±4,688 отн. ед.) по сравнению с пациентами 1-й группы. У пациентов 3-й группы уровень ОШ был статистически значимое ниже, чем у пациентов 1-й группы, на 60-, 90-й минутах и далее до конца операции.

---

Таблица 4. Динамика содержания оснований Шиффа у больных, отн. ед. (M±SD)

---

Изменения агрегации эритроцитов во время операции представлены в табл. 5. У пациентов 1-й группы отсутствовали статистически значимые изменения параметра на этапах доперфузионного периода, а затем наблюдалось статистически значимое возрастание показателя с 30-й минуты ИК до окончания операции (с 44,8±1,4 до 73,1±2,2%). Агрегация эритроцитов у пациентов 2-й группы снижалась в ходе ИК: с 56,5±2,3% перед началом до 47,4±1,2% — по его окончании. Агрегация эритроцитов у больных 3-й группы снижалась в ходе всей операции и была статистически значимо ниже, чем у больных 1-й и 2-й групп начиная с 30-й минуты ИК и до момента окончания операции. При этом надо заметить, что в начале операции в 3-й группе агрегация эритроцитов была статистически значимо выше, чем в 1-й группе. Статистически значимое снижение агрегации эритроцитов у больных 3-й группы обеспечивало лучшее состояние микроциркуляции и доставку кислорода органам и тканям в ходе и по окончании ИК.

---

Таблица 5. Динамика агрегации эритроцитов в ходе операции, % (M±SD)

---

Клинические исходы представлены в табл. 6. Частота развития острой сердечной недостаточности у пациентов 2-й и 3-й групп была статистически значимо (точный критерий Фишера) ниже (p=0,046) по сравнению с 1-й группой. Статистически значимых различий по частоте острой дыхательной недостаточности и полиорганной недостаточности у пациентов 2-й и 3-й групп по сравнению с 1-й группой не выявлено. При этом у пациентов 2-й и 3-й групп каких-либо осложнений в раннем послеоперационном периоде не наблюдалось.

---

Таблица 6. Клинические исходы у больных

---

Как следует из представленных в табл. 6 данных, у пациентов 3-й группы отмечено статистически значимое снижение продолжительности искусственной вентиляции лёгких после операции, а соответственно, и продолжительности пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) по сравнению со 2-й группой.

Таким образом, комбинированное применение газообразного оксида азота и водорода в ходе ИК позволило статистически значимо снизить уровень активации ПОЛ и агрегации эритроцитов в ходе операции и ИК, что обеспечивало более высокий уровень органопротекции при кардиохирургическом вмешательстве, более быструю активизацию пациентов и снижение продолжительности их пребывания в ОРИТ.

Обсуждение

Была проведена оценка влияния на процессы ПОЛ и агрегацию эритроцитов как изолированного применения оксида азота, так и его комбинации с водородом по сравнению с группой контроля, обеспечение которой выполнялось по стандартным протоколам, не включавшим применение данных препаратов.

Эффективность изолированного введения газообразного оксида азота в контур аппарата ИК отмечена в ряде работ последних лет [13–15]. Однако в них сделан акцент на кардио­протективное воздействие препарата в ходе кардиохирургического вмешательства и не изучено влияние оксида азота на процессы ПОЛ и состояние эритроцитов, хотя системное повреждающее воздействие на клетку продуктов ПОЛ общеизвестно. Полученные нами в ходе исследования данные свидетельствуют о снижении показателей ПОЛ при ИК, вызванном изолированным применением газообразного оксида азота. Оксид азота также значимо влиял и на состояние эритроцитов, снижая их агрегацию в ходе операции с ИК.

Ранее проведенные клинические исследования, посвященные изолированному применению молекулярного водорода в кардиохирургии, ограничиваются его ингаляционным применением на этапах до- или после ИК. Анализ результатов исследования венозной и артериальной крови свидетельствует, что снижение концентрации продуктов ПОЛ в послеоперационном периоде в группе пациентов, получавших ингаляции водорода, было связано с проявлением прямого антиоксидантного действия молекулярного водорода и возможным опосредованным влиянием его через модуляцию концентрации активных форм кислорода, являющихся естественными сигнальными мессенджерами и имеющих важное значение для регуляции деятельности клеток [10]. Кроме того, показано, что использование молекулярного водорода способствует поддержанию концентрации АТФ и статистически значимому увеличению содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах артериальной крови по сравнению с группой контроля [16]. Исследований, касающихся подачи молекулярного водорода в контур аппарата ИК, оценки его влияния на процессы ПОЛ и состояние эритроцитов, до настоящего времени не проводилось.

Публикуемые нами данные являются пилотным исследованием, посвященным комбинированному применению двух газов — оксида азота и молекулярного водорода, одновременно подаваемых в контур аппарата ИК в ходе выполнения кардиохирургических вмешательств. Показано эффективное влияние комбинированного применения данных препаратов не только на снижение процессов ПОЛ и состояние эритроцитов, но и на клинические исходы операции. По результатам проведенного исследования подана заявка на изобретение №2022130057 «Способ предупреждения органного повреждения при проведении искусственного кровообращения во время кардиохирургических вмешательств» от 18.11.2022.

Заключение

Проведенное нами исследование показало, что комбинированное применение газообразного оксида азота и молекулярного водорода в ходе искусственного кровообращения позволило статистически значимо снизить уровень активации перекисного окисления липидов и агрегации эритроцитов во время операции, что обеспечивало более высокий уровень органопротекции при кардиохирургическом вмешательстве, более быструю активизацию пациентов и снижение продолжительности их пребывания в отделении реанимации и интенсивной терапии.

Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось никакими источниками, и конфликты интересов, связанные с данной работой, отсутствуют.