Одновременное применение двух фотосенсибилизаторов — метиленового синего и хлорина е6: исследование на культуре клеток

Применение фотосенсибилизаторов для подавления окислительного фосфорилирования с целью временного снижения потребления кислорода опухолевыми клетками в ходе фотодинамической терапии (ФДТ) вызывает растущий интерес.

Цель. Исследование направлено на преодоление гипоксии опухолей для дальнейшего проведения фотодинамической терапии при одновременном использовании двух фотосенсибилизаторов: метиленового синего (МС) и хлорина e6, относящихся к I и II типам соответственно.

Материалы и методы. Проведено исследование фотодинамической активности МС и МС в комбинации с хлорином е6 на культуре клеток HeLa и оценено их влияние на клеточный метаболизм при совместном накоплении и последующем облучении.

Результаты. МС в клетках генерирует активные формы кислорода, в отличие от хлорина е6, который продуцирует синглетный кислород. Кроме того, при невысоких концентрациях в процессе дезоксигенации МС переходит в бесцветную лейкоформу. Инкубация клеток с МС одновременно с хлорином е6 приводит к большей флуоресценции его внутри клеток по сравнению с инкубацией клеток только с МС. Концентрации МС в диапазоне 1–10 мг/кг и доза лазерного облучения 60 Дж/см² не вызывают гибели клеток, вероятно из-за перехода МС в фотодинамически неактивную лейкоформу. Для всех образцов с хлорином е6 и с МС в диапазоне концентраций 0–20 мг/кг и в дозе 60 Дж/см² наблюдается гибель клеток после ФДТ. Совместная фототоксичность МС и хлорина е6 выше, чем одного хлорина е6. Анализ времени жизни флуоресценции метаболического кофактора NADH после инкубации клеток с МС и хлорином е6 и после ФДТ с ними выявил наличие стресса, проявляемого как вытягивание облака флуоресценции NADH вдоль метаболической оси. После ФДТ с невысокими концентрациями МС происходит смещение облака флуоресценции NADH на фазорной диаграмме вправо, в сторону коротких времен жизни (ближе к анаэробному гликолизу по метаболической траектории NADH). ФДТ с МС и хлорином е6 приводит к смещению облака флуоресценции NADH на фазорной диаграмме влево, в сторону длинных времен жизни (ближе к окислительному фосфорилированию по метаболической траектории NADH), клетки при этом погибают в результате некроза.

Заключение. Совместное накопление МС в комбинации с хлорином е6 нарушает восстановление МС в бесцветную лейкоформу, при этом снижается потребление кислорода клетками, в результате чего становится возможным одновременно задействовать фотодинамические реакции I и II типа.

1. Du J., Shi T., Long S., Chen P., Sun W., Fan J., Peng X. Enhanced photodynamic therapy for overcoming tumor hypoxia: from microenvironment regulation to photosensitizer innovation. Coordination Chemistry Reviews 2021; 427: 213604, https://doi.org/10.1016/j.ccr.2020.213604.
2. Wan Y., Fu L.H., Li C., Lin J., Huang P. Conquering the hypoxia limitation for photodynamic therapy. Adv Mater 2021; 33(48): e2103978, https://doi.org/10.1002/adma.202103978.
3. Li X., Chen L., Huang M., Zeng S., Zheng J., Peng S., Wang Y., Cheng H., Li S. Innovative strategies for photodynamic therapy against hypoxic tumor. Asian J Pharm Sci 2023; 18(1): 100775, https://doi.org/10.1016/j.ajps.2023.100775.
4. Vander Heiden M.G., Cantley L.C., Thompson C.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 2009; 324(5930): 1029–1033, https://doi.org/10.1126/science.1160809.
5. Su Y., Lu K., Huang Y., Zhang J., Sun X., Peng J., Zhou Y., Zhao L. Targeting Warburg effect to rescue the suffocated photodynamic therapy: a cancer-specific solution. Biomaterials 2023; 294: 122017, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122017.
6. Gao F., Dong J.H., Xue C., Lu X.X., Cai Y., Tang Z.Y., Ou C.J. Tumor-targeting multiple metabolic regulations for bursting antitumor efficacy of chemodynamic therapy. Small 2024; 20(26): e2310248, https://doi.org/10.1002/smll.202310248.
7. Yuan P., Deng F.A., Liu Y.B., Zheng R.R., Rao X.N., Qiu X.Z., Zhang D.W., Yu X.Y., Cheng H., Li S.Y. Mitochondria targeted O2 economizer to alleviate tumor hypoxia for enhanced photodynamic therapy. Adv Healthc Mater 2021; 10(12): e2100198, https://doi.org/10.1002/adhm.202100198.
8. Chen Q., Chen J., Liang C., Feng L., Dong Z., Song X., Song G., Liu Z. Drug-induced co-assembly of albumin/catalase as smart nano-theranostics for deep intra-tumoral penetration, hypoxia relieve, and synergistic combination therapy. J Control Release 2017; 263: 79–89, https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2016.11.006.
9. Colegio O.R., Chu N.Q., Szabo A.L., Chu T., Rhebergen A.M., Jairam V., Cyrus N., Brokowski C.E., Eisenbarth S.C., Phillips G.M., Cline G.W., Phillips A.J., Medzhitov R. Functional polarization of tumour-associated macrophages by tumour-derived lactic acid. Nature 2014; 513(7519): 559–563, https://doi.org/10.1038/nature13490.
10. Huber V., Camisaschi C., Berzi A., Ferro S., Lugini L., Triulzi T., Tuccitto A., Tagliabue E., Castelli C., Rivoltini L. Cancer acidity: an ultimate frontier of tumor immune escape and a novel target of immunomodulation. Semin Cancer Biol 2017; 43: 74–89, https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2017.03.001.
11. Jiang H., Jedoui M., Ye J. The Warburg effect drives dedifferentiation through epigenetic reprogramming. Cancer Biol Med 2024; 20(12): 891–897, https://doi.org/10.20892/j.issn.2095-3941.2023.0467.
12. Komlódi T., Tretter L. Methylene blue stimulates substrate-level phosphorylation catalysed by succinyl-CoA ligase in the citric acid cycle. Neuropharmacology 2017; 123: 287–298, https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2017.05.009.
13. Xue H., Thaivalappil A., Cao K. The potentials of methylene blue as an anti-aging drug. Cells 2021; 10(12): 3379, https://doi.org/10.3390/cells10123379.
14. Pominova D., Ryabova A., Skobeltsin A., Markova I., Linkov K., Romanishkin I. The use of methylene blue to control the tumor oxygenation level. Photodiagnosis Photodyn Ther 2024; 46: 104047, https://doi.org/10.1016/j.pdpdt.2024.104047.
15. Bouillaud F., Ransy C., Moreau M., Benhaim J., Lombès A., Haouzi P. Methylene blue induced O2 consumption is not dependent on mitochondrial oxidative phosphorylation: implications for salvage pathways during acute mitochondrial poisoning. Respir Physiol Neurobiol 2022; 304: 103939, https://doi.org/10.1016/j.resp.2022.103939.
16. Balcerczyk A., Damblon C., Elena-Herrmann B., Panthu B., Rautureau G.J.P. Metabolomic approaches to study chemical exposure-related metabolism alterations in mammalian cell cultures. Int J Mol Sci 2020; 21(18): 6843, https://doi.org/10.3390/ijms21186843.
17. Ranjit S., Malacrida L., Jameson D.M., Gratton E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc 2018; 13(9): 1979–2004, https://doi.org/10.1038/s41596-018-0026-5.
18. Alhayaza R., Haque E., Karbasiafshar C., Sellke F.W., Abid M.R. The relationship between reactive oxygen species and endothelial cell metabolism. Front Chem 2020; 8: 592688, https://doi.org/10.3389/fchem.2020.592688.
19. Junqueira H.C., Severino D., Dias L.G., Gugliotti M.S., Baptista M.S. Modulation of methylene blue photochemical properties based on adsorption at aqueous micelle interfaces. PCCP 2002; 11: 2320–2328, https://doi.org/10.1039/b109753a.
20. Fernández-Pérez A., Marbán G. Visible light spectroscopic analysis of methylene blue in water; what comes after dimer? ACS Omega 2020; 5(46): 29801–29815, https://doi.org/10.1021/acsomega.0c03830.
21. Dean J.C., Oblinsky D.G., Rather S.R., Scholes G.D. Methylene blue exciton states steer nonradiative relaxation: ultrafast spectroscopy of methylene blue dimer. J Phys Chem B 2016; 120(3): 440–454, https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.5b11847.
22. Kalinina S., Freymueller C., Naskar N., von Einem B., Reess K., Sroka R., Rueck A. Bioenergetic alterations of metabolic redox coenzymes as NADH, FAD and FMN by means of fluorescence lifetime imaging techniques. Int J Mol Sci 2021; 22(11): 5952, https://doi.org/10.3390/ijms22115952.
23. Ranjit S., Malacrida L., Stakic M., Gratton E. Determination of the metabolic index using the fluorescence lifetime of free and bound nicotinamide adenine dinucleotide using the phasor approach. J Biophotonics 2019; 12(11): e201900156, https://doi.org/10.1002/jbio.201900156.
24. Vermathen M., Vermathen P., Simonis U., Bigler P. Time-dependent interactions of the two porphyrinic compounds chlorin e6 and mono-L-aspartyl-chlorin e6 with phospholipid vesicles probed by NMR spectroscopy. Langmuir 2008; 24(21): 12521–12533, https://doi.org/10.1021/la802040v.
25. Vermathen M., Marzorati M., Vermathen P., Bigler P. pH-dependent distribution of chlorin e6 derivatives across phospholipid bilayers probed by NMR spectroscopy. Langmuir 2010; 26(13): 11085–11094, https://doi.org/10.1021/la100679y.
26. Marzorati M., Bigler P., Vermathen M. Interactions between selected photosensitizers and model membranes: an NMR classification. Biochim Biophys Acta 2011; 1808(6): 1661–1672, https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2011.02.011.
27. Vermathen M., Kämpfer T., Nuoffer J.M., Vermathen P. intracellular fate of the photosensitizer chlorin e4 with different carriers and induced metabolic changes studied by 1H NMR spectroscopy. Pharmaceutics 2023; 15(9): 2324, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics15092324.
28. Gabrielli D., Belisle E., Severino D., Kowaltowski A.J., Baptista M.S. Binding, aggregation and photochemical properties of methylene blue in mitochondrial suspensions. Photochem Photobiol 2004; 79(3): 227–232, https://doi.org/10.1562/be-03-27.1.
29. Iqbal M.J., Kabeer A., Abbas Z., Siddiqui H.A., Calina D., Sharifi-Rad J., Cho W.C. Interplay of oxidative stress, cellular communication and signaling pathways in cancer. Cell Commun Signal 2024; 22(1): 7, https://doi.org/10.1186/s12964-023-01398-5.
30. Rusz M., Del Favero G., El Abiead Y., Gerner C., Keppler B.K., Jakupec M.A., Koellensperger G. Morpho-metabotyping the oxidative stress response. Sci Rep 2021; 11(1): 15471, https://doi.org/10.1038/s41598-021-94585-8.
31. Argüello R.J., Combes A.J., Char R., Gigan J.P., Baaziz A.I., Bousiquot E., Camosseto V., Samad B., Tsui J., Yan P., Boissonneau S., Figarella-Branger D., Gatti E., Tabouret E., Krummel M.F., Pierre P. SCENITH: a flow cytometry-based method to functionally profile energy metabolism with single-cell resolution. Cell Metab 2020; 32(6): 1063–1075.e7, https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.11.007.
32. Miskolci V., Tweed K.E., Lasarev M.R., Britt E.C., Walsh A.J., Zimmerman L.J., McDougal C.E., Cronan M.R., Fan J., Sauer J.D., Skala M.C., Huttenlocher A. In vivo fluorescence lifetime imaging of macrophage intracellular metabolism during wound responses in zebrafish. Elife 2022; 11: e66080, https://doi.org/10.7554/eLife.66080.
33. Datta R., Alfonso-García A., Cinco R., Gratton E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep 2015; 5: 9848, https://doi.org/10.1038/srep09848.
34. Shi D.Y., Xie F.Z., Zhai C., Stern J.S., Liu Y., Liu S.L. The role of cellular oxidative stress in regulating glycolysis energy metabolism in hepatoma cells. Mol Cancer 2009; 8: 32, https://doi.org/10.1186/1476-4598-8-32.
35. Leben R., Köhler M., Radbruch H., Hauser A.E., Niesner R.A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free NAD(P)H fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci 2019; 20(22): 5565, https://doi.org/10.3390/ijms20225565.

Ryabova A.V., Romanishkin I.D., Markova I.V., Pominova D.V. Simultaneous Application of Methylene Blue and Chlorin e6 Photosensitizers: Investigation on a Cell Culture. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(1): 58, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.1.06