Цитопротекторное действие фумарата натрия в условиях in vitro модели гипоксии с применением дитионита натрия

Гипоксия является составляющей многих патологических и ряда физиологических процессов. Она также возникает в результате применения хирургических техник, связанных с ограничением кровоснабжения оперируемых органов и тканей. Это приводит к значительному снижению способности клеток осуществлять энергозависимые процессы за счет уменьшения вклада митохондрий в синтез аденозинтрифосфата (АТФ). Для защиты клеток и увеличения времени операции предложена инфузия раствора фумарата Na в течение нескольких дней до хирургической процедуры. Однако механизм наблюдаемого при этом защитного эффекта остается предметом обсуждения.

Цель исследования — изучение механизма цитопротекторного действия фумарата Na в отношении клеток почечного эпителия при моделировании острой гипоксии in vitro путем восстановления кислорода в среде дитионитом Na.

Материалы и методы. Исследования выполнены на клеточной линии эпителия почек MDCK с использованием дитионита Na в концентрации 5 мМ для создания условий гипоксии. Оценку параметров клеточного метаболизма, включая величину митохондриального мембранного потенциала, состояние митохондриальных НАДН и ФАД, содержание ионов Са²⁺ и Mg²⁺ и уровня рН в цитозоле, скорость поглощения клетками глюкозы, развитие клеточной гибели, проводили методами конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии. Определение концентрации растворенного кислорода выполняли полярографическим методом с помощью электрода Кларка.

Результаты. Показано, что применение дитионита Na позволяет моделировать состояние острой гипоксии in vitro с быстрым снижением концентрации кислорода в среде инкубирования клеток, приводящим к изменению функции митохондрий и развитию апоптоза. При этом присутствие фумарата Na снижает уровень клеточной гибели, что связано не с восстановлением АТФ-продуцирующей способности митохондрий, а с увеличением вклада альтернативных источников макроэрга.

Заключение. На клеточном уровне с использованием оптимизированной модели гипоксии показан механизм защитной роли фумарата Na, объясняющий эффективность антигипоксанта при искусственной ишемизации органов и тканей.

1. Lee J.W., Ko J., Ju C., Eltzschig H.K. Hypoxia signaling in human diseases and therapeutic targets. Exp Mol Med 2019; 51(6): 1–13, https://doi.org/10.1038/s12276-019-0235-1.
2. Della Rocca Y., Fonticoli L., Rajan T.S., Trubiani O., Caputi S., Diomede F., Pizzicannella J., Marconi G.D. Hypoxia: molecular pathophysiological mechanisms in human diseases. J Physiol Biochem 2022; 78(4): 739–752, https://doi.org/10.1007/s13105-022-00912-6.
3. Thompson R.H., Kaag M., Vickers A., Kundu S., Bernstein M., Lowrance W., Galvin D., Dalbagni G., Touijer K., Russo P. Contemporary use of partial nephrectomy at a tertiary care center in the United States. J Urol 2009; 181(3): 993–997, https://doi.org/10.1016/j.juro.2008.11.017.
4. Mir M.C., Ercole C., Takagi T., Zhang Z., Velet L., Remer E.M., Demirjian S., Campbell S.C. Decline in renal function after partial nephrectomy: etiology and prevention. J Urol 2015; 193(6): 1889–1898, https://doi.org/10.1016/j.juro.2015.01.093.
5. Funahashi Y., Yoshino Y., Sassa N., Matsukawa Y., Takai S., Gotoh M. Comparison of warm and cold ischemia on renal function after partial nephrectomy. Urology 2014; 84(6): 1408–1412, https://doi.org/10.1016/j.urology.2014.08.040.
6. Попов С.В., Гусейнов Р.Г., Скрябин О.Н., Сивак К.В. Тепловая ишемия почки. М: ГЭОТАР-Медиа 2021; 272 с.
7. Литвицкий П.Ф. Гипоксия. Вопросы современной педиатрии 2016; 15(1): 45–58.
8. Kirkali Z. The motion: open partial nephrectomy is the standard of care for small resectable solid renal masses. Eur Urol 2007; 51(2): 561–564, https://doi.org/10.1016/j.eururo.2006.10.030.
9. Damasceno-Ferreira J.A., Bechara G.R., Costa W.S., Pereira-Sampaio M.A., Sampaio F.J.B., Souza D.B. The relationship between renal warm ischemia time and glomerular loss. An experimental study in a pig model. Acta Cir Bras 2017; 32(5): 334–341, https://doi.org/10.1590/s0102-865020170050000002.
10. Orvieto M.A., Zorn K.C., Mendiola F.P., Gong E.M., Lucioni A., Mikhail A.A., Gofrit O.N., Shalhav A.L. Ischemia preconditioning does not confer resilience to warm ischemia in a solitary porcine kidney model. Urology 2007; 69(5): 984–987, https://doi.org/10.1016/j.urology.2007.01.100.
11. Simmons M.N., Schreiber M.J., Gill I.S. Surgical renal ischemia: a contemporary overview. J Urol 2008; 180(1): 19–30, https://doi.org/10.1016/j.juro.2008.03.022.
12. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (Молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения). М: Медицина; 1989; 368 с.
13. Thompson R.H., Lane B.R., Lohse C.M., Leibovich B.C., Fergany A., Frank I., Gill I.S., Campbell S.C., Blute M.L. Comparison of warm ischemia versus no ischemia during partial nephrectomy on a solitary kidney. Eur Urol 2010; 58(3): 331–336, https://doi.org/10.1016/j.eururo.2010.05.048.
14. Buys-Gonçalves G.F., Abreu L.A.S., Gregorio B.M., Sampaio F.J.B., Pereira-Sampaio M.A., de Souza D.B. Antioxidants as renoprotective agents for ischemia during partial nephrectomy. Biomed Res Int 2019; 2019: 8575398, https://doi.org/10.1155/2019/8575398.
15. Gonçalves G.F.B., Silva M.E.M., Sampaio F.J.B., Pereira-Sampaio M.A., de Souza D.B. Quercetin as a nephroprotector after warm ischemia: histomorphometric evaluation in a rodent model. Int Braz J Urol 2021; 47(4): 796–802, https://doi.org/10.1590/S1677-5538.IBJU.2020.0358.
16. Damasceno-Ferreira J.A., Abreu L.A.S., Bechara G.R., Costa W.S., Pereira-Sampaio M.A., Sampaio F.J.B., De Souza D.B. Mannitol reduces nephron loss after warm renal ischemia in a porcine model. BMC Urol 2018; 18(1): 16, https://doi.org/10.1186/s12894-018-0328-5.
17. Дряженков И.Г., Комлев Д.Л., Лось М.С. Факторы ишемического повреждения почки при ее резекции. Кли­ническая медицина 2013; 91(6): 21–25.
18. Weinberg J.M., Venkatachalam M.A., Roeser N.F., Saikumar P., Dong Z., Senter R.A., Nissim I. Anaerobic and aerobic pathways for salvage of proximal tubules from hypoxia-induced mitochondrial injury. Am J Physiol Renal Physiol 2000; 279(5): F927–F943, https://doi.org/10.1152/ajprenal.2000.279.5.F927.
19. Weinberg J.M., Venkatachalam M.A., Roeser N.F., Nissim I. Mitochondrial dysfunction during hypoxia/reoxygenation and its correction by anaerobic metabolism of citric acid cycle intermediates. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97(6): 2826–2831, https://doi.org/10.1073/pnas.97.6.2826.
20. Spinelli J.B., Rosen P.C., Sprenger H.G., Puszynska A.M., Mann J.L., Roessler J.M., Cangelosi A.L., Henne A., Condon K.J., Zhang T., Kunchok T., Lewis C.A., Chandel N.S., Sabatini D.M. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science 2021; 374(6572): 1227–1237, https://doi.org/10.1126/science.abi7495.
21. MacKenzie E.D., Selak M.A., Tennant D.A., Payne L.J., Crosby S., Frederiksen C.M., Watson D.G., Gottlieb E. Cell-permeating alpha-ketoglutarate derivatives alleviate pseudohypoxia in succinate dehydrogenase-deficient cells. Mol Cell Biol 2007; 27(9): 3282–3289, https://doi.org/10.1128/MCB.01927-06.
22. Pollard P.J., Brière J.J., Alam N.A., Barwell J., Barclay E., Wortham N.C., Hunt T., Mitchell M., Olpin S., Moat S.J., Hargreaves I.P., Heales S.J., Chung Y.L., Griffiths J.R., Dalgleish A., McGrath J.A., Gleeson M.J., Hodgson S.V., Poulsom R., Rustin P., Tomlinson I.P. Accumulation of Krebs cycle intermediates and over-expression of HIF1alpha in tumours which result from germline FH and SDH mutations. Hum Mol Genet 2005; 14(15): 2231–2239, https://doi.org/10.1093/hmg/ddi227.
23. Sudarshan S., Linehan W.M., Neckers L. HIF and fumarate hydratase in renal cancer. Br J Cancer 2007; 96(3): 403–407, https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6603547.
24. Shanmugasundaram K., Nayak B., Shim E.H., Livi C.B., Block K., Sudarshan S. The oncometabolite fumarate promotes pseudohypoxia through noncanonical activation of NF-κB signaling. J Biol Chem 2014; 289(35): 24691–24699, https://doi.org/10.1074/jbc.M114.568162.
25. Laukka T., Mariani C.J., Ihantola T., Cao J.Z., Hokkanen J., Kaelin W.G. Jr, Godley L.A., Koivunen P. Fumarate and succinate regulate expression of hypoxia-inducible genes via TET enzymes. J Biol Chem 2016; 291(8): 4256–4265, https://doi.org/10.1074/jbc.M115.688762.
26. Ooi A., Furge K.A. Fumarate hydratase inactivation in renal tumors: HIF1α, NRF2, and “cryptic targets” of transcription factors. Chin J Cancer 2012; 31(9): 413–420, https://doi.org/10.5732/cjc.012.10102.
27. Sethi K., Rao K., Shulkes A., Baldwin G., Bolton D., Patel O., Ischia J. Targeting HIF-1α to prevent renal ischemia-reperfusion injury: does it work? Int J Cell Biol 2019; 2019: 9598038, https://doi.org/10.1155/2018/9852791.
28. Li Q.Y., Liu F., Tang X., Fu H., Mao J. renoprotective role of hypoxia-inducible factors and the mechanism. Kidney Dis (Basel) 2021; 8(1): 44–56, https://doi.org/10.1159/000520141.
29. Muñoz-Sánchez J., Chánez-Cárdenas M.E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol 2019; 39(4): 556–570, https://doi.org/10.1002/jat.3749.
30. Piret J.P., Mottet D., Raes M., Michiels C. CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2. Ann N Y Acad Sci 2002; 973: 443–447, https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2002.tb04680.x.
31. Tuboly E., Szabó A., Garab D., Bartha G., Janovszky Á., Erős G., Szabó A., Mohácsi Á., Szabó G., Kaszaki J., Ghyczy M., Boros M. Methane biogenesis during sodium azide-induced chemical hypoxia in rats. Am J Physiol Cell Physiol 2013; 304(2): C207–C214, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00300.2012.
32. Rinderknecht H., Ehnert S., Braun B., Histing T., Nussler A.K., Linnemann C. The art of inducing hypoxia. Oxygen 2021; 1(1): 46–61, https://doi.org/10.3390/oxygen1010006.
33. Lawson W.H. Jr, Holland R.A., Forster R.E. Effect of temperature on deoxygenation rate of human red cells. J Appl Physiol 1965; 20(5): 912–918, https://doi.org/10.1152/jappl.1965.20.5.912.
34. Zhao R.Z., Jiang S., Ru N.Y., Jiao B., Yu Z.B. Comparison of hypoxic effects induced by chemical and physical hypoxia on cardiomyocytes. Can J Physiol Pharmacol 2019; 97(10): 980–988, https://doi.org/10.1139/cjpp-2019-0092.
35. Mueller S., Millonig G., Waite G.N. The GOX/CAT system: a novel enzymatic method to independently control hydrogen peroxide and hypoxia in cell culture. Adv Med Sci 2009; 54(2): 121–135, https://doi.org/10.2478/v10039-009-0042-3.
36. Jayaraman T., Tejero J., Chen B.B., Blood A.B., Frizzell S., Shapiro C., Tiso M., Hood B.L., Wang X., Zhao X., Conrads T.P., Mallampalli R.K., Gladwin M.T. 14-3-3 binding and phosphorylation of neuroglobin during hypoxia modulate six-to-five heme pocket coordination and rate of nitrite reduction to nitric oxide. J Biol Chem 2011; 286(49): 42679–42689, https://doi.org/10.1074/jbc.M111.271973.
37. Qin X., Liu B., Gao F., Hu Y., Chen Z., Xu J., Zhang X. Gluconolactone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury and arrhythmias via activating PKCε/extracellular signal-regulated kinase signaling. Front Physiol 2022; 13: 856699, https://doi.org/10.3389/fphys.2022.856699.
38. Saxena K., Jolly M.K. Acute vs. chronic vs. cyclic hypoxia: their differential dynamics, molecular mechanisms, and effects on tumor progression. Biomolecules 2019; 9(8): 339, https://doi.org/10.3390/biom9080339.
39. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W., Itoh Y., Hasegawa J., Yamabe K., Otsuki Y., Matsuda H., Tsujimoto Y. Induction of apoptosis as well as necrosis by hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl-XL. Cancer Res 1996; 56(9): 2161–2166.
40. Shen S., Shao Y., Li C. Different types of cell death and their shift in shaping disease. Cell Death Discov 2023; 9(1): 284, https://doi.org/10.1038/s41420-023-01581-0.
41. Bracken C.P., Fedele A.O., Linke S., Balrak W., Lisy K., Whitelaw M.L., Peet D.J. Cell-specific regulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and HIF-2alpha stabilization and transactivation in a graded oxygen environment. J Biol Chem 2006; 281(32): 22575–22585, https://doi.org/10.1074/jbc.M600288200.
42. Cheng X., Vinokurov A.Y., Zherebtsov E.A., Stelmashchuk O.A., Angelova P.R., Esteras N., Abramov A.Y. Variability of mitochondrial energy balance across brain regions. J Neurochem 2021; 157(4): 1234–1243, https://doi.org/10.1111/jnc.15239.
43. Seryogina E.S., Kamynina A.V., Koroev D.O., Volpina O.M., Vinokurov A.Y., Abramov A.Y. RAGE induces physiological activation of NADPH oxidase in neurons and astrocytes and neuroprotection. FEBS J 2024; 291(9): 1944–1957, https://doi.org/10.1111/febs.17086.
44. Esteras N., Blacker T.S., Zherebtsov E.A., Stelmashuk O.A., Zhang Y., Wigley W.C., Duchen M.R., Dinkova-Kostova A.T., Abramov A.Y. Nrf2 regulates glucose uptake and metabolism in neurons and astrocytes. Redox Biol 2023; 62: 102672, https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102672.
45. Berezhnov A.V., Soutar M.P., Fedotova E.I., Frolova M.S., Plun-Favreau H., Zinchenko V.P., Abramov A.Y. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. J Biol Chem 2016; 291(16): 8701–8708, https://doi.org/10.1074/jbc.M115.691774.
46. Zorova L.D., Popkov V.A., Plotnikov E.Y., Silachev D.N., Pevzner I.B., Jankauskas S.S., Babenko V.A., Zorov S.D., Balakireva A.V., Juhaszova M., Sollott S.J., Zorov D.B. Mitochondrial membrane potential. Anal Biochem 2018; 552: 50–59, https://doi.org/10.1016/j.ab.2017.07.009.
47. Zhivotosky B., Orrenius S. Assessment of apoptosis and necrosis by DNA fragmentation and morphological criteria. Curr Protoc Cell Biol 2001; 18: 18.3.1–18.3.23, https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1803s12.
48. Chinopoulos C. Which way does the citric acid cycle turn during hypoxia? The critical role of α-ketoglutarate dehydrogenase complex. J Neurosci Res 2013; 91(8): 1030–1043, https://doi.org/10.1002/jnr.23196.
49. Vinokurov A.Y., Soldatov V.O., Seregina E.S., Dolgikh A.I., Tagunov P.A., Dunaev A.V., Skorkina M.Y., Deykin A.V., Abramov A.Y. HPRT1 deficiency induces alteration of mitochondrial energy metabolism in the brain. Mol Neurobiol 2023; 60(6): 3147–3157, https://doi.org/10.1007/s12035-023-03266-2.
50. Ishikawa Y., Kitamura M. Inhibition of glomerular cell apoptosis by heparin. Kidney Int 1999; 56(3): 954–963, https://doi.org/10.1046/j.1523-1755.1999.00639.x.
51. Bhadra K. A mini review on molecules inducing caspase-independent cell death: a new route to cancer therapy. Molecules 2022; 27(19): 6401, https://doi.org/10.3390/molecules27196401.
52. Wheaton W.W., Chandel N.S. Hypoxia. 2. Hypoxia regulates cellular metabolism. Am J Physiol Cell Physiol 2011; 300(3): C385–C393, https://doi.org/10.1152/ajpcell.00485.2010.
53. Shiratori R., Furuichi K., Yamaguchi M., Miyazaki N., Aoki H., Chibana H., Ito K., Aoki S. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep 2019; 9(1): 18699, https://doi.org/10.1038/s41598-019-55296-3.
54. Lang K.S., Mueller M.M., Tanneur V., Wallisch S., Fedorenko O., Palmada M., Lang F., Bröer S., Heilig C.W., Schleicher E., Weigert C. Regulation of cytosolic pH and lactic acid release in mesangial cells overexpressing GLUT1. Kidney Int 2003; 64(4): 1338–1347, https://doi.org/10.1046/j.1523-1755.2003.00213.x.

Vinokurov A.Yu., Popov S.V., Belyakov D.Yu., Popov D.Yu., Nikulin A.S., Zakrzhevskaya V.D., Guseinov R.G., Sivak K.V., Dunaev A.V., Potapova E.V., Abramov A.Yu. Cytoprotective Action of Sodium Fumarate in an in vitro Model of Hypoxia Using Sodium Dithionite. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(1): 93, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.1.09