Оценка эффективности воздействия «усиленных» естественных киллеров, нокаутных по генам CISH и B2M, на жизнеспособность и метаболический статус клеток 3D-сфероидов глиобластомы пациентов

Одним из альтернативных подходов к лечению глиобластомы выступает клеточная иммунотерапия на основе естественных, или натуральных, киллеров (NK-клеток). Для усиления их цитотоксического эффекта на опухолевые клетки с помощью генно-инженерных технологий создаются новые NK-клеточные линии.

Цель исследования — оценить эффективность влияния «усиленных» NK-клеток на ранние метаболические перестройки и жизнеспособность клеток глиобластомы пациента на модели опухолевых сфероидов.

Материалы и методы. В исследовании использованы первичная культура глиобластомы человека GBM7-Luc2-mKate2, библиотечная линия NK-клеток человека YT дикого типа (YTwt), а также созданные нами линии со сверхэкспрессией белка VAV1 и нокаутированные либо по гену CISH (YT–Vav1⁺CISH^–/–), либо по гену B2M (YT–Vav1⁺B2M^–/–). Опухолевые сфероиды формировали в круглодонных низкоадгезивных планшетах. Иммунные клетки добавляли к сфероидам в количестве 100 тыс. клеток на 1 сфероид, и на нескольких временны´х точках оценивали жизнеспособность сфероидов путем флуоресцентного окрашивания с использованием набора живые/мертвые клетки, а также проводили визуализацию автофлуоресценции метаболического кофермента никотинамидадениндинуклеотида (фосфата) — НАД(Ф)Н — в сфероидах с использованием лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия) с приставкой FLIM (Becker & Hickl GmbH, Германия).

Результаты. Установлено, что параметры затухания автофлуоресценции кофермента НАД(Ф)Н в клетках глиобластомы человека существенно изменяются при воздействии как YT–Vav1⁺CISH^–/–, так и YT–Vav1⁺B2M^–/–, что указывает на возникновение раннего метаболического сдвига в опухолевых клетках в сторону менее агрессивного окислительного фенотипа, и это согласуется с увеличением фракции погибших и снижением фракции живых клеток в составе сфероида.

Заключение. Полученные данные об усиленной цитотоксической активности новых модифицированных NK-клеточных линий в отношении сфероидов глиобластомы человека имеют важное значение для понимания механизмов взаимодействия опухолевых и иммунных клеток и развития адоптивной клеточной терапии глиобластомы.

1. Lim M., Xia Y., Bettegowda C., Weller M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat Rev Clin Oncol 2018; 15(7): 422–442, https://doi.org/10.1038/s41571-018-0003-5.
2. Mahmoud A.B., Ajina R., Aref S., Darwish M., Alsayb M., Taher M., AlSharif S.A., Hashem A.M., Alkayyal A.A. Advances in immunotherapy for glioblastoma multiforme. Front Immunol 2022; 13: 944452, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.944452.
3. Liu Y., Zhou F., Ali H., Lathia J.D., Chen P. Immunotherapy for glioblastoma: current state, challenges, and future perspectives. Cell Mol Immunol 2024; 21(12): 1354–1375, https://doi.org/10.1038/s41423-024-01226-x.
4. Mamessier E., Sylvain A., Thibult M.L., Houvenaeghel G., Jacquemier J., Castellano R., Gonçalves A., André P., Romagné F., Thibault G., Viens P., Birnbaum D., Bertucci F., Moretta A., Olive D. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest 2011; 121(9): 3609–3622, https://doi.org/10.1172/JCI45816.
5. Suen W.C., Lee W.Y., Leung K.T., Pan X.H., Li G. Natural killer cell-based cancer immunotherapy: a review on 10 years completed clinical trials. Cancer Invest 2018; 36(8): 431–457, https://doi.org/10.1080/07357907.2018.1515315.
6. Cooksey L.C., Friesen D.C., Mangan E.D., Mathew P.A. Prospective molecular targets for natural killer cell immunotherapy against glioblastoma multiforme. Cells 2024; 13(18): 1567, https://doi.org/10.3390/cells13181567.
7. Bryceson Y.T., Chiang S.C., Darmanin S., Fauriat C., Schlums H., Theorell J., Wood S.M. Molecular mechanisms of natural killer cell activation. J Innate Immun 2011; 3(3): 216–226, https://doi.org/10.1159/000325265.
8. da Silva L.H.R., Catharino L.C.C., da Silva V.J., Evangelista G.C.M., Barbuto J.A.M. The war is on: the immune system against glioblastoma-how can NK cells drive this battle? Biomedicines 2022; 10(2): 400, https://doi.org/10.3390/biomedicines10020400.
9. Malmberg K.J., Carlsten M., Björklund A., Sohlberg E., Bryceson Y.T., Ljunggren H.G. Natural killer cell-mediated immunosurveillance of human cancer. Semin Immunol 2017; 31: 20–29, https://doi.org/10.1016/j.smim.2017.08.002.
10. Yusubalieva G.M., Dashinimaev E.B., Gorchakov A.A., Kulemzin S.V., Brovkina O.A., Kalinkin A.A., Vinokurov A.G., Shirmanova M.V., Baklaushev V.P. Enhanced natural killers with CISH and B2M gene knockouts reveal increased cytotoxicity in glioblastoma primary cultures. Mol Biol 2022; 56: 770–779, https://doi.org/10.1134/S0026893322050156.
11. Chan G., Hanke T., Fischer K.D. Vav-1 regulates NK T cell development and NK cell cytotoxicity. Eur J Immunol 2001; 31(8): 2403–2410, https://doi.org/10.1002/1521-4141(200108)31:8 2403::aid-immu24033.0.co;2-o.
12. Delconte R.B., Kolesnik T.B., Dagley L.F., Rautela J., Shi W., Putz E.M., Stannard K., Zhang J.G., Teh C., Firth M., Ushiki T., Andoniou C.E., Degli-Esposti M.A., Sharp P.P., Sanvitale C.E., Infusini G., Liau N.P., Linossi E.M., Burns C.J., Carotta S., Gray D.H., Seillet C., Hutchinson D.S., Belz G.T., Webb A.I., Alexander W.S., Li S.S., Bullock A.N., Babon J.J., Smyth M.J., Nicholson S.E., Huntington N.D. CIS is a potent checkpoint in NK cell-mediated tumor immunity. Nat Immunol 2016; 17(7): 816–824, https://doi.org/10.1038/ni.3470.
13. Höglund P., Glas R., Ménard C., Kåse A., Johansson M.H., Franksson L., Lemmonier F., Kärre K. Beta2-microglobulin-deficient NK cells show increased sensitivity to MHC class I-mediated inhibition, but self tolerance does not depend upon target cell expression of H-2Kb and Db heavy chains. Eur J Immunol 1998; 28(1): 370–378, https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-4141(199801)28:01%3C370::AID-IMMU370%3E3.0.CO;2-W.
14. Mitrakas A.G., Tsolou A., Didaskalou S., Karkaletsou L., Efstathiou C., Eftalitsidis E., Marmanis K., Koffa M. Applications and advances of multicellular tumor spheroids: challenges in their development and analysis. Int J Mol Sci 2023; 24(8): 6949, https://doi.org/10.3390/ijms24086949.
15. Щеславский В.И., Ширманова М.В., Ельцов A., Бек­кер В. Люминесцентная микроскопия на основе многопараметрического время-коррелированного счета фотонов. Успехи биологической химии 2019; 59: 103–138.
16. Multimodal optical diagnostics of cancer. Tuchin V.V., Popp J., Zakharov V. (editors). Cham: Springer International Publishing; 2020.
17. Druzhkova I., Komarova A., Nikonova E., Baigildin V., Mozherov A., Shakirova Y., Lisitsa U., Shcheslavskiy V., Ignatova N., Shirshin E., Shirmanova M., Tunik S. Monitoring the intracellular pH and metabolic state of cancer cells in response to chemotherapy using a combination of phosphorescence lifetime imaging microscopy and fluorescence lifetime imaging microscopy. Int J Mol Sci 2023; 25(1): 49, https://doi.org/10.3390/ijms25010049.
18. Yuzhakova D.V., Sachkova D.A., Shirmanova M.V., Mozherov A.M., Izosimova A.V., Zolotova A.S., Yashin K.S. Measurement of patient-derived glioblastoma cell response to temozolomide using fluorescence lifetime imaging of NAD(P)H. Pharmaceuticals (Basel) 2023; 16(6): 796, https://doi.org/10.3390/ph16060796.
19. Yuzhakova D., Kiseleva E., Shirmanova M., Shcheslavskiy V., Sachkova D., Snopova L., Bederina E., Lukina M., Dudenkova V., Yusubalieva G., Belovezhets T., Matvienko D., Baklaushev V. Highly invasive fluorescent/bioluminescent patient-derived orthotopic model of glioblastoma in mice. Front Oncol 2022; 12: 897839, https://doi.org/10.3389/fonc.2022.897839.
20. Yuzhakova D.V., Lukina M.M., Sachkova D.A., Yusubalieva G.M., Baklaushev V.P., Mozherov A.M., Dudenkova V.V., Gavrina A.I., Yashin K.S., Shirmanova M.V. Development of a 3D tumor spheroid model from the patient’s glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(2): 28–38, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.2.03.
21. Tao J.H., Zhang J., Li H.S., Zhou Y., Guan C.X. Nature killer cell for solid tumors: current obstacles and prospective remedies in NK cell therapy and beyond. Crit Rev Oncol Hematol 2025; 205: 104553, https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2024.104553.
22. Chu J., Gao F., Yan M., Zhao S., Yan Z., Shi B., Liu Y. Natural killer cells: a promising immunotherapy for cancer. J Transl Med 2022; 20(1): 240, https://doi.org/10.1186/s12967-022-03437-0
23. Feldman L., Brown C., Badie B. Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy for glioblastoma. Neuromolecular Med 2022; 24(1): 35–40, https://doi.org/10.1007/s12017-021-08689-5.
24. Rautela J., Huntington N.D. IL-15 signaling in NK cell cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol 2017; 44: 1–6, https://doi.org/10.1016/j.coi.2016.10.004.
25. Ahmadzadeh M., Rosenberg S.A. IL-2 administration increases CD4+ CD25(hi) Foxp3+ regulatory T cells in cancer patients. Blood 2006; 107(6): 2409–2414, https://doi.org/10.1182/blood-2005-06-2399.
26. Felices M., Lenvik A.J., McElmurry R., Chu S., Hinderlie P., Bendzick L., Geller M.A., Tolar J., Blazar B.R., Miller J.S. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. JCI Insight 2018; 3(3): e96219, https://doi.org/10.1172/jci.insight.96219.
27. Lukina M.M., Dudenkova V.V., Shimolina L.E., Snopova L.B., Zagaynova E.V., Shirmanova M.V. In vivo metabolic and SHG imaging for monitoring of tumor response to chemotherapy. Cytometry A 2019; 95(1): 47–55, https://doi.org/10.1002/cyto.a.23607.
28. Lukina M.M., Dudenkova V.V., Ignatova N.I., Druzhkova I.N., Shimolina L.E., Zagaynova E.V., Shirmanova M.V. Metabolic cofactors NAD(P)H and FAD as potential indicators of cancer cell response to chemotherapy with paclitaxel. Biochim Biophys Acta Gen Subj 2018; 1862(8): 1693–1700, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2018.04.021.
29. Shirmanova M.V., Druzhkova I.N., Lukina M.M., Dudenkova V.V., Ignatova N.I., Snopova L.B., Shcheslavskiy V.I., Belousov V.V., Zagaynova E.V. Chemotherapy with cisplatin: insights into intracellular pH and metabolic landscape of cancer cells in vitro and in vivo. Sci Rep 2017; 7(1): 8911, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09426-4.
30. Shah A.T., Demory Beckler M., Walsh A.J., Jones W.P., Pohlmann P.R., Skala M.C. Optical metabolic imaging of treatment response in human head and neck squamous cell carcinoma. PLoS One 2014; 9(3): e90746, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090746.
31. Alam S.R., Wallrabe H., Svindrych Z., Chaudhary A.K., Christopher K.G., Chandra D., Periasamy A. Investigation of mitochondrial metabolic response to doxorubicin in prostate cancer cells: an NADH, FAD and tryptophan FLIM assay. Sci Rep 2017; 7(1): 10451, https://doi.org/10.1038/s41598-017-10856-3.
32. Song A., Zhao N., Hilpert D.C., Perry C., Baur J.A., Wallace D.C., Schaefer P.M. Visualizing subcellular changes in the NAD(H) pool size versus redox state using fluorescence lifetime imaging microscopy of NADH. Commun Biol 2024; 7(1): 428, https://doi.org/10.1038/s42003-024-06123-7.
33. Zhao J., Ma X., Gao P., Han X., Zhao P., Xie F., Liu M. Advancing glioblastoma treatment by targeting metabolism. Neoplasia 2024; 51: 100985, https://doi.org/10.1016/j.neo.2024.100985.
34. Principles of fluorescence spectroscopy. Lakowicz J.R. (editor). Boston: Springer US; 2006.
35. Morrow C.S., Yao P., Vergani-Junior C.A., Anekal P.V., Llopis P.M., Miller J.W., Benayoun B.A., Mair W.B. Endogenous mitochondrial NAD(P)H fluorescence can predict lifespan. Commun Biol 2024; 7: 1551, https://doi.org/10.1038/s42003-024-07243-w.
36. Sanchez T., Wang T., Pedro M.V., Zhang M., Esencan E., Sakkas D., Needleman D., Seli E. Metabolic imaging with the use of fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) accurately detects mitochondrial dysfunction in mouse oocytes. Fertil Steril 2018; 110(7): 1387–1397, https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2018.07.022.
37. Yang J., Shay C., Saba N.F., Teng Y. Cancer metabolism and carcinogenesis. Exp Hematol Oncol 2024; 13(1): 10, https://doi.org/10.1186/s40164-024-00482-x.
38. Heinrich M.A., Huynh N.T., Heinrich L., Prakash J. Understanding glioblastoma stromal barriers against NK cell attack using tri-culture 3D spheroid model. Heliyon 2024; 10(3): e24808, https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e24808.

Yuzhakova D.V., Sachkova D.A., Shirmanova M.V., Shcheslavskiy V.I., Mozherov A.M., Dashinimaev E.B., Baklaushev V.P., Yusubalieva G.M. Efficacy Evaluation of “Enhanced” Natural Killers with CISH and B2M Knockouts on Viability and Metabolic Status of 3D Glioblastoma Spheroid Cells in Patients. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(1): 109, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.1.10