Разработка ДНК-биочипа для индикации вирусных возбудителей внебольничной пневмонии

Цель исследования — разработка ДНК-биочипа для индикации вирусных возбудителей внебольничной пневмонии.

Материалы и методы. Материалом исследования служили мазки слизистой оболочки носо- и ротоглотки пациентов в возрасте от 2 мес до 18 лет с подтвержденным диагнозом «пневмония». Подбор ДНК-зондов для детекции возбудителей выполняли с использованием нуклеотидных последовательностей из баз данных NCBI Nucleotide и GISAID и с помощью собственной программы disprose. Подобранные ДНК-зонды синтезировали на слайды компании CustomArray (США). На модельном пулированном образце, содержащем ДНК аденовируса и РНК коронавируса SARS-CoV-2, осуществляли подбор оптимальной температуры гибридизации, при которой наблюдали максимальный процент зондов со стандартизированными сигналами гибридизации (ССГ) ≥3 Z, а уровни ССГ специфичных зондов превышали уровни ССГ неспецифичных зондов. Далее в ходе гибридизации на биочипы исследуемых образцов при выбранных условиях проводили отбор эффективных ДНК-зондов для детекции вирусных возбудителей внебольничной пневмонии. С помощью ROC-анализа устанавливали пороговые значения уровня сигналов специфичных зондов, превышение которых свидетельствует о наличии возбудителя.

Результаты. Выбрано 544 ДНК-зонда для детекции аденовируса, бокавируса, респираторно-синцитиального вируса, мета­пневмовируса, вируса парагриппа человека, риновируса и коронавируса. ДНК-зонды были синтезированы на слайды. Установлена оптимальная температура гибридизации ДНК на биочипы (47°С). Составлен перечень эффективных зондов для специфической детекции аденовируса группы B, бокавируса, вируса парагриппа человека типа 3, респираторно-синцитиального вируса, риновируса и коронавируса SARS-CoV-2. Определены пороговые значения уровня ССГ специфичных зондов для детекции возбудителей внебольничной пневмонии в клинических образцах.

Заключение. Разработан ДНК-биочип для индикации вирусных возбудителей внебольничной пневмонии. Составлен перечень специфичных ДНК-зондов и определены пороговые значения уровня их сигналов, превышение которых свидетельствует о наличии соответствующего возбудителя в клиническом образце. Биочипы позволяют оптимизировать лабораторную диагностику вирусных возбудителей внебольничной пневмонии.

1. Watkins R.R., Lemonovich T.L. Diagnosis and management of community-acquired pneumonia in adults. Am Fam Physician 2011; 83(11): 1299–1306.
2. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2023 году: государственный доклад. М: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; 2024. URL: https://rospotrebnadzor.ru/upload/iblock/fbc/sd3prfszlc9c2r4xbmsb7o3us38nrvpk/ Gosudarstvennyy-doklad-_O-sostoyanii-sanitarno_ epidemiologicheskogo-blagopoluchiya-naseleniya-v- Rossiyskoy-Federatsii-v-2023-godu_..pdf.
3. Holter J.C., Müller F., Bjørang O., Samdal H.H., Marthinsen J.B., Jenum P.A., Ueland T., Frøland S.S., Aukrust P., Husebye E., Heggelund L. Etiology of community-acquired pneumonia and diagnostic yields of microbiological methods: a 3-year prospective study in Norway. BMC Infect Dis 2015; 15: 64, https://doi.org/10.1186/s12879-015-0803-5.
4. Waterer G.W. Diagnosing viral and atypical pathogens in the setting of community-acquired pneumonia. Clin Chest Med 2017; 38(1): 21–28, https://doi.org/10.1016/j.ccm.2016.11.004.
5. Wiemken T.L., Peyrani P., Ramirez J.A. Global changes in the epidemiology of community-acquired pneumonia. Semin Respir Crit Care Med 2012; 33(3): 213–219, https://doi.org/10.1055/s-0032-1315633.
6. Shah B.A., Ahmed W., Dhobi G.N., Shah N.N., Khursheed S.Q., Haq I. Validity of pneumonia severity index and CURB-65 severity scoring systems in community acquired pneumonia in an Indian setting. Indian J Chest Dis Allied Sci 2010; 52(1): 9–17.
7. Meyer Sauteur P.M. Childhood community-acquired pneumonia. Eur J Pediatr 2024; 183(3): 1129–1136, https://doi.org/10.1007/s00431-023-05366-6.
8. Jansen R.R., Wieringa J., Koekkoek S.M., Visser C.E., Pajkrt D., Molenkamp R., de Jong M.D., Schinkel J. Frequent detection of respiratory viruses without symptoms: toward defining clinically relevant cutoff values. J Clin Microbiol 2011; 49(7): 2631–2636, https://doi.org/10.1128/JCM.02094-10.
9. Eads B., Cash A., Bogart K., Costello J., Andrews J. Troubleshooting microarray hybridizations. Methods Enzymol 2006; 411: 34–49, https://doi.org/10.1016/S0076-6879(06)11003-4.
10. Gardner S.N., Jaing C.J., McLoughlin K.S., Slezak T.R. A microbial detection array (MDA) for viral and bacterial detection. BMC Genomics 2010; 11: 668, https://doi.org/10.1186/1471-2164-11-668.
11. Thissen J.B., McLoughlin K., Gardner S., Gu P., Mabery S., Slezak T., Jaing C. Analysis of sensitivity and rapid hybridization of a multiplexed microbial detection microarray. J Virol Methods 2014; 201: 73–78, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.01.024.
12. Thissen J.B., Be N.A., McLoughlin K., Gardner S., Rack P.G., Shapero M.H., Rowland R.R.R., Slezak T., Jaing C.J. Axiom microbiome array, the next generation microarray for high-throughput pathogen and microbiome analysis. PLoS One 2019; 14(2): e0212045, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212045.
13. Ferreira I.C.S., Alegretti A.P., De Paris F., Paiva R.M., Chakr V.C.B.G. Comparison of a direct immunofluorescence assay (Oxoid IMAGEN®) and a multiplex RT-PCR DNA microarray assay (CLART® PneumoVir) for the detection of respiratory viruses in hospitalized children. J Virol Methods 2020; 284: 113930, https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2020.113930.
14. Filatova E.N., Chaikina A.S., Brusnigina N.F., Makhova M.A., Utkin O.V. An Algorithm for the selection of probes for specific detection of human disease pathogens using the DNA microarray technology. Sovremennye tehnologii v medicine 2022; 14(1): 6–12, https://doi.org/10.17691/stm2022.14.1.01.
15. National Center for Biotechnology Information. Nucleotide. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide.
16. The GISAID database. URL: https://www.gisaid.org.
17. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing; 2022. URL: https://www.R-project.org.
18. RStudio Team (2020). RStudio: integrated development for R. Boston: RStudio, PBC; 2020. URL: http://www.rstudio.com.
19. Liu R.H., Dill K., Fuji H.S., McShea A. Integrated microfluidic biochips for DNA microarray analysis. Expert Rev Mol Diagn 2006; 6(2): 253–261, https://doi.org/10.1586/14737159.6.2.253.
20. Sakharnov N.A., Filatova E.N., Popkova M.I., Slavin S.L., Utkin O.V. Development of DNA microarray for parallel detection of community-acquired pneumonia bacterial pathogens. Sovremennye tehnologii v medicine 2024; 16(2): 16–26, https://doi.org/10.17691/stm2024.16.2.02.
21. You Y.H., Wang P., Wang Y.H., Wang H.B., Yu D.Z., Hai R., Zhang J.Z. Assessment of comparative genomic hybridization experiment by an in situ synthesized CombiMatrix microarray with Yersinia pestis vaccine strain EV76 DNA. Biomed Environ Sci 2010; 23(5): 384–390, https://doi.org/10.1016/S0895-3988(10)60080-3.
22. Camacho C., Coulouris G., Avagyan V., Ma N., Papadopoulos J., Bealer K., Madden T.L. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics 2009; 10:421, https://doi.org/10.1186/1471-2105-10-421.
23. Raman T., O’Connor T.P., Hackett N.R., Wang W., Harvey B.G., Attiyeh M.A., Dang D.T., Teater M., Crystal R.G. Quality control in microarray assessment of gene expression in human airway epithelium. BMC Genomics 2009; 10: 493, https://doi.org/10.1186/1471-2164-10-493.
24. Ghindilis A.L., Smith M.W., Schwarzkopf K.R., Roth K.M., Peyvan K., Munro S.B., Lodes M.J., Stöver A.G., Bernards K., Dill K., McShea A. CombiMatrix oligonucleotide arrays: genotyping and gene expression assays employing electrochemical detection. Biosens Bioelectron 2007; 22(9-10): 1853–1860, https://doi.org/10.1016/j.bios.2006.06.024.
25. Ashwood B., Jones M.S., Radakovic A., Khanna S., Lee Y., Sachleben J.R., Szostak J.W., Ferguson A.L., Tokmakoff A. Thermodynamics and kinetics of DNA and RNA dinucleotide hybridization to gaps and overhangs. Biophys J 2023; 122(16): 3323–3339, https://doi.org/10.1016/j.bpj.2023.07.009.

Sakharnov N.A., Filatova E.N., Popkova M.I., Lukovnikova L.B., Bahmeteva M.O., Slavin S.L., Utkin O.V. Development of DNA Microarray for Indication of Viral Community-Acquired Pneumonia Pathogens. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(3): 17, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.3.02