Двухфотонная микроскопия стромы молочной железы ex vivo для использования в экспресс-диагностике рака

Цель исследования — оценка возможности экспресс-анализа ex vivo биопсийных образцов тканей молочной железы с помощью двухфотонной микроскопии (ДФМ).

Материалы и методы. Объектами исследования послужили образцы тканей молочной железы, полученные в ходе плановой трепан-биопсии. Проведено сравнение ДФМ-изображений стромы молочной железы в биопсийных ex vivo образцах и в неокрашенных депарафинированных срезах толщиной 10 мкм. В исследование включены образцы от пациенток с фиброаденомой (2 случая), карциномой in situ (1 случай) и инвазивной карциномой неспецифического типа I–II степени (4 случая). В рамках численной обработки ДФМ-изображений выполнено построение карт фактора дезорганизации коллагена, основанного на пространственном Фурье-анализе.

Результаты. Продемонстрирована возможность применения метода ДФМ для выявления ремоделирования стромы тканей молочной железы при доброкачественных и злокачественных изменениях с использованием биопсийных образцов. Получены характерные изображения биопсийных образцов и срезов стромы молочной железы в норме, при фиброаденоме и при различных вариантах карциномы, выявлены качественные отличия между типичными изображениями доброкачественных и злокачественных новообразований молочной железы. Изучены изменения структуры коллагеновых волокон и наличие/отсутствие эластиновых волокон при рассмотренных патологических состояниях молочной железы. Показаны различия ДФМ-изображений биопсийных ex vivo образцов и депарафинированных срезов, что может быть результатом искажения формы волокон в процессе обработки образцов. Предложенный алгоритм количественной обработки изображений позволяет объективизировать результаты визуализации, что является существенным шагом на пути к автоматизированной экспресс-диагностике.

Заключение. Двухфотонная микроскопия обладает высоким потенциалом в качестве метода экспресс-биопсии при первичной диагностике тканей молочной железы, а также при интраоперационном применении.

1. International Agency for Research on Cancer. GLOBOCAN 2018. URL: https://www.iarc.fr/.
2. Franceschini G., Sanchez A.M., Di Leone A., Magno S., Moschella F., Accetta C., Natale M., Di Giorgio D., Scaldaferri A., D’Archi S., Scardina L., Masetti R. Update on the surgical management of breast cancer. Ann Ital Chir 2015; 86(2): 89–99.
3. Driul L., Bernardi S., Bertozzi S., Schiavon M., Londero A.P., Petri R. New surgical trends in breast cancer treatment: conservative interventions and oncoplastic breast surgery. Minerva Ginecol 2013; 65(3): 289–296.
4. Franceschini G., Martin Sanchez A., Di Leone A., Magno S., Moschella F., Accetta C., Masetti R. New trends in breast cancer surgery: a therapeutic approach increasingly efficacy and respectful of the patient. G Chir 2015; 36(4): 145–152, https://doi.org/10.11138/gchir/2015.36.4.145.
5. Alfano R.R. Advances in optical biopsy for cancer diagnosis. Technol Cancer Res Treat 2011; 10(2): 101, https://doi.org/10.7785/tcrt.2012.500184.
6. Nie Z., An R., Hayward J.E., Farrell T.J., Fang Q. Hyperspectral fluorescence lifetime imaging for optical biopsy. J Biomed Opt 2013; 18(9): 096001, https://doi.org/10.1117/1.jbo.18.9.096001.
7. Boppart S.A., Richards-Kortum R. Point-of-care and point-of-procedure optical imaging technologies for primary care and global health. Sci Transl Med 2014; 6(253): 253rv2, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.3009725.
8. Li G., Li H., Duan X., Zhou Q., Zhou J., Oldham K.R., Wang T.D. Visualizing epithelial expression in vertical and horizontal planes with dual axes confocal endomicroscope using compact distal scanner. IEEE Trans Med Imaging 2017; 36(7): 1482–1490, https://doi.org/10.1109/tmi.2017.2673022.
9. Gao Z., Li G., Li X., Zhou J., Duan X., Chen J., Joshi B.P., Kuick R., Khoury B., Thomas D.G., Fields T., Sabel M.S., Appelman H.D., Zhou Q., Li H., Kozloff K., Wang T.D. In vivo near-infrared imaging of ErbB2 expressing breast tumors with dual-axes confocal endomicroscopy using a targeted peptide. Sci Rep 2017; 7(1): 14404, https://doi.org/10.1038/s41598-017-13735-z.
10. Perry S.W., Burke R.M., Brown E.B. Two-photon and second harmonic microscopy in clinical and translational cancer research. Ann Biomed Eng 2012; 40(2): 277–291, https://doi.org/10.1007/s10439-012-0512-9.
11. König K., Riemann I., Ehlers A., Bückle R., Dimitrow E., Kaatz M., Fluhr J., Elsner P. In vivo multiphoton tomography of skin cancer. Proc. SPIE, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences 2006; 6089: 60890R, https://doi.org/10.1117/12.646000.
12. Jain M., Robinson B., Scherr D., Sterling J., Lee M., Wysock J., Rubin M., Maxfield F., Zipfel W., Webb W., Mukherjee S. Multiphoton microscopy in the evaluation of human bladder biopsies. Arch Pathol Lab Med 2012; 136(5): 517–526, https://doi.org/10.5858/arpa.2011-0147-oa.
13. Yan J., Zhuo S., Chen G., Milsom J.W., Zhang H., Lu J., Zhu W., Xie S., Chen J., Ying M. Real-time optical diagnosis for surgical margin in low rectal cancer using multiphoton microscopy. Surg Endosc 2014; 28: 36–41, https://doi.org/10.1007/s00464-013-3153-7.
14. Stanciu S.G., Xu S., Peng Q., Yan J., Stanciu G.A., Welsch R.E., So P.T., Csucs G., Yu H. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and bag-of-features image classification. Sci Rep 2014; 4: 4636, https://doi.org/10.1038/srep04636.
15. Wu Y., Fu F., Lian Y., Chen J., Wang C., Nie Y., Zheng L., Zhuo S. Monitoring morphological alterations during invasive ductal breast carcinoma progression using multiphoton microscopy. Lasers Med Sci 2015; 30(3): 1109–1115, https://doi.org/10.1007/s10103-015-1712-y.
16. Denk W., Strickler J.H., Webb W.W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science 1990; 248(4951): 73–76, https://doi.org/10.1126/science.2321027.
17. Cicchi R., Kapsokalyvas D., De Giorgi V., Maio V., Van Wiechen A., Massi D., Lotti T., Pavone F.S. Scoring of collagen organization in healthy and diseased human dermis by multiphoton microscopy. J Biophotonics 2010; 3(1–2): 34–43, https://doi.org/10.1002/jbio.200910062.
18. Cicchi R., Matthäus C., Meyer T., Lattermann A., Dietzek B., Brehm B.R., Popp J., Pavone F.S. Characterization of collagen and cholesterol deposition in atherosclerotic arterial tissue using nonlinear microscopy. J Biophoton 2014; 7(1–2): 135–143, https://doi.org/10.1002/jbio.201300055.
19. Gubarkova E.V., Kirillin M.Y., Dudenkova V.V., Timashev P.S., Kotova S.L., Kiseleva E.B., Timofeeva L.B., Belkova G.V., Solovieva A.B., Moiseev A.A., Gelikonov G.V., Fiks I.I., Feldchtein F.I., Gladkova N.D. Quantitative evaluation of atherosclerotic plaques using cross-polarization optical coherence tomography, nonlinear, and atomic force microscopy. J Biomed Opt 2016; 21(12): 126010, https://doi.org/10.1117/1.jbo.21.12.126010.
20. Wu S., Li H., Yang H., Zhang X., Li Z., Xu S. Quantitative analysis on collagen morphology in aging skin based on multiphoton microscopy. J Biomed Opt 2011; 16(4): 040502, https://doi.org/10.1117/1.3565439.
21. Osman O.S., Selway J.L., Harikumar P.E., Stocker C.J., Wargent E.T., Cawthorne M.A., Jassim S., Langlands K. A novel method to assess collagen architecture in skin. BMC Bioinformatics 2013; 14(1): 260, https://doi.org/10.1186/1471-2105-14-260.
22. Zipfel W.R., Williams R.M., Christie R., Nikitin A.Y., Hyman B.T., Webb W.W. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(12): 7075–7080, https://doi.org/10.1073/pnas.0832308100.
23. Malandrino A., Mak M., Kamm R.D., Moeendarbary E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters 2018; 21: 25–34, https://doi.org/10.1016/j.eml.2018.02.003.
24. Luparello C. Aspects of collagen changes in breast cancer. Journal of Carcinogenesis & Mutagenesis 2013; S13: 007, https://doi.org/10.4172/2157-2518.s13-007.
25. Мнихович М.В. Межклеточные и клеточно-мат­риксные взаимодействия в карциномах молочной железы: современное состояние проблемы. Российский медико-био­логический вестник им. академика И.П. Павлова 2014; 22(2): 152–161, https://doi.org/10.17816/pavlovj20142152-161.
26. Clark A.G., Vignjevic D.M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment Curr Opin Cell Biol 2015; 36: 13–22, https://doi.org/10.1016/j.ceb.2015.06.004.
27. Iovino F., Ferraraccio F., Orditura M., Antoniol G., Morgillo F., Cascone T., Diadema M.R., Aurilio G., Santabarbara G., Ruggiero R., Belli C., Irlandese E., Fasano M., Ciardiello F., Procaccini E., Lo Schiavo F., Catalano G., De Vita F. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF) levels correlate with tumor VEGF and p53 overexpression in endocrine positive primary breast cancer. Cancer Invest 2008; 26(3): 250–255, https://doi.org/10.1080/07357900701560612.
28. Han X., Burke R.M., Zettel M.L., Tang P., Brown E.B. Second harmonic properties of tumor collagen: determining the structural relationship between reactive stroma and healthy stroma. Opt Express 2008; 16(3): 1846–1859, https://doi.org/10.1364/oe.16.001846.
29. Aboussekhra A. Role of cancer-associated fibroblasts in breast cancer development and prognosis. Int J Dev Biol 2011; 55(7–9): 841–849, https://doi.org/10.1387/ijdb.113362aa.
30. Provenzano P.P., Inman D.R., Eliceiri K.W., Knittel J.G., Yan L., Rueden C.T., White J.G., Keely P.J. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med 2008; 6(1): 11, https://doi.org/10.1186/1741-7015-6-11.
31. Provenzano P., Eliceiri K.W., Yan L., Ada-Nguema A., Conklin M.W., Inman D.R., Keely P.J. Nonlinear optical imaging of cellular processes in breast cancer. Microsc Microanal 2008; 14(6): 532–548, https://doi.org/10.1017/s1431927608080884.
32. Conklin M.W., Eickhoff J.C., Riching K.M., Pehlke C.A., Eliceiri K.W., Provenzano P.P., Friedl A., Keely P.J. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol 2011; 178(3): 1221–1232, https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2010.11.076.
33. Burke K., Tang P., Brown E. Second harmonic generation reveals matrix alterations during breast tumor progression. J Biomed Opt 2013; 18(3): 031106, https://doi.org/10.1117/1.jbo.18.3.031106.
34. Ambekar R., Lau T.Y., Walsh M., Bhargava R., Toussaint K.C. Jr. Quantifying collagen structure in breast biopsies using second-harmonic generation imaging. Biomed Opt Express 2012; 3(9): 2021–2035, https://doi.org/10.1364/boe.3.002021.
35. Wu X., Chen G., Lu J., Zhu W., Qiu J., Chen J., Xie S., Zhuo S., Yan J. Label-free detection of breast masses using multiphoton microscopy. PLoS One 2013; 8(6): e65933, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065933.
36. Natal R.A., Vassallo J., Paiva G.R., Pelegati V.B., Barbosa G.O., Mendonça G.R., Bondarik C., Derchain S.F., Carvalho H.F., Lima C.S., Cesar C.L., Sarian L.O. Collagen analysis by second-harmonic generation microscopy predicts outcome of luminal breast cancer. Tumor Biol 2018; 40(4): 1010428318770953, https://doi.org/10.1177/1010428318770953.
37. Wang Y., Lu S., Xiong J., Singh K., Hui Y., Zhao C., Brodsky A.S., Yang D., Jolly G., Ouseph M., Schorl C., DeLellis R.A., Resnick M.B. ColXα1 is a stromal component that colocalizes with elastin in the breast tumor extracellular matrix. J Pathol Clin Res 2019; 5(1): 40–52, https://doi.org/10.1002/cjp2.115.
38. Uchiyama S., Fukuda Y. Abnormal elastic fibers in elastosis of breast carcinoma. Ultrastructural and immunohistochemical studies. Acta Pathol Jpn 1989; 39(4): 245–253.
39. Elasbali A.M., Al-Onzi Z., Hamza A., Khalafalla E., Ahmed H.G. Morphological patterns of elastic and reticulum fibers in breast lesions. Health 2018; 10(12): 1625–1633, https://doi.org/10.4236/health.2018.1012122.

Sergeeva E.A., Kirillin M.Yu., Dudenkova V.V., Pavlov M.V., Orlinskaya N.Yu., Shakhova N.M. Two-Photon Microscopy of Stroma ex vivo for the Express Diagnostics of Breast Cancer. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(3): 89, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.3.12