Определение диапазона неинвазивного воздействия фемтосекундными лазерными импульсами ближнего инфракрасного спектра для нанохирургии ооцитов млекопитающих
Цель исследования — определить интервал неинвазивного воздействия фемтосекундных лазерных импульсов ближнего инфракрасного диапазона для внутриклеточной нанохирургии ооцитов млекопитающих и оценить способность ооцитов к дальнейшему развитию in vitro в зависимости от энергии импульса и суммарной дозы падающего излучения.
Материалы и методы. В работе использовали преовуляторные ооциты мыши на стадии зародышевого пузырька. Воздействие осуществляли излучением фемтосекундного лазера с длиной волны 780 нм в двух режимах: 1) одиночный импульс длительностью 30 фс, энергия импульса — 100 нДж; 2) цуги фемтосекундных импульсов длительностью 100 фс, частота следования импульсов — 80 МГц (время между импульсами — 12,5 нс), энергия импульса — 0,5–2 нДж, длительность всего цуга составляла от 15 до 60 мс. Излучение фокусировали объективом микроскопа ×60 с числовой апертурой 0,7. Ооциты культивировали до стадии метафазы второго деления мейоза, достижение этой стадии использовали в качестве показателя инвазивности воздействия. Данную стадию определяли по образованию направительного тельца и метафазной пластинки.
Результаты. Определен порог инвазивности для режима облучения одиночными фемтосекундными импульсами. В режиме работы 30 фс, 100 нДж происходит разрыв цитоплазматической мембраны и разрушение клетки.
Воздействие на цитоплазму и ядро ооцитов цугами фемтосекундных импульсов не приводит к повреждению образцов. Измерена частота образования парогазовых пузырьков после воздействия лазерным излучением на цитоплазму и хроматин ядра. Энергия импульса 1 нДж является порогом образования пузырьков в цитоплазме, 2 нДж — в ядре. Воздействие в режиме фемтосекундных импульсов длительностью 100 фс с частотой повторения 80 МГц в исследованном диапазоне энергий импульса и длительностей цуга не влияет на способность ооцитов к развитию до стадии метафазы II.
Заключение. В диапазоне энергии импульса, не более чем в два раза превышающей энергию порога образования парогазовых пузырьков, и суммарной экспозиции воздействия фемтосекундная лазерная нанохирургия может рассматриваться как малоинвазивный метод внутриклеточной хирургии.
- Надточенко В.А., Мельников М.Я. Лазерная нанохирургия клеток и эмбрионов. В кн.: Синтез, строение и свойства металл/полупроводник содержащих наноструктурированных композитов. Под ред. Трахтенберг Л.И., Мельникова М.Я. M: Техносфера; 2016; с. 441–473.
- Nuzzo V., Maxwell I., Chung S., Mazur E., Heisterkamp A. Subcellular surgery and nanoneurosurgery using femtosecond laser pulses. In: Biophotonics: spectroscopy, imaging, sensing, and manipulation. DiBartolo B., Collins J. (editors). Springer; 2011; p. 203–218, https://doi.org/10.1007/978-90-481-9977-8_9.
- Osychenko A.A., Zalesskii A.D., Krivokharchenko A.S., Zhakhbazyan A.K., Ryabova A.V., Nadtochenko V.A. Fusion of blastomeres in mouse embryos under the action of femtosecond laser radiation.
Efficiency of blastocyst formation and embryo development. Quantum Electronics 2015; 45(5): 498–502, https://doi.org/10.1070/qe2015v045n05abeh015767. - Vogel A., Noack J., Hüttman G., Paltauf G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B 2005; 81(8): 1015–1047, https://doi.org/10.1007/s00340-005-2036-6.
- Shishova K.V., Khodarovich Y.M., Lavrentyeva E.A., Zatsepina O.V. High-resolution microscopy of active ribosomal genes and key members of the rRNA processing machinery inside nucleolus-like bodies of
fully-grown mouse oocytes. Experimental Cell Research 2015; 337(2): 208–218, https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2015.07.024. - Shakhov A.M., Astafiev A.A., Plutenko D.O., Sarkisov O.M., Shushin A.I., Nadtochenko V.A. Femtosecond optical
trap-assisted nanopatterning through microspheres by a singleTi:Sapphire oscillator. The Journal of Physical Chemistry C 2015; 119(22): 12562–12571, https://doi.org/10.1021/acs.jpcc.5b00478. - Astaf’ev A.A., Shakhov A.M., Sarkisov O.M., Nadtochenko V.A. Microstructuring of polymer films by femtosecond pulses through optically trapped polystyrene microspheres. Quantum Electronics 2013; 43(4): 361–364, https://doi.org/10.1070/qe2013v043n04abeh015114.
Sarpe C., Köhler J., Winkler T., Wollenhaupt M., Baumert T. Real-time observation of transient electron density in water irradiated with tailored femtosecond laser pulses. New Journal of Physics 2012; 14(7): 075021, https://doi.org/10.1088/1367-2630/14/7/075021.
