Применение вирусного вектора AAV-Syn-BDNF-EGFP как нейропротективного агента при моделировании гипоксии in vitro

Цель исследования — разработать и изучить влияние вирусного вектора AAV-Syn-BDNF-EGFP на жизнеспособность первичных культур клеток гиппокампа в норме и при моделировании одного из факторов ишемии (гипоксии) in vitro.

Материалы и методы. Для разработки вирусного конструкта были использованы плазмиды AAV-Syn-EGFP, pDP5, DJvector, pHelper. Тестирование разработанного вектора выполняли на культуре диссоциированных клеток гиппокампа, полученных от эмбрионов мышей линии C57BL/6 18-го дня гестации. Инфицирование первичных культур разработанным вирусным конструктом проводили на 7-е сутки культивирования (7 DIV). Оценивали жизнеспособность и спонтанную биоэлектрическую активность клеток в культуре на 1, 3 и 7-е сутки после инфицирования. На 7-е сутки после инфицирования (14 DIV) также проводили анализ спонтанной кальциевой активности диссоциированных культур с помощью функционального кальциевого имиджинга. Для оценки нейропротекторных свойств разработанного конструкта на 14-й день (14 DIV) культивирования выполняли моделирование гипоксии in vitro.

Результаты. Разработан аденоассоциированный вирусный вектор AAV-Syn-BDNF-EGFP, несущий последовательность гена BDNF и предназначенный для увеличения экспрессии нейротрофического фактора головного мозга. Показано, что применение данного вектора для инфицирования первичных культур клеток гиппокампа мыши приводит к увеличению продукции BDNF клетками культуры. Разработанный вирусный вектор не оказывает негативного влияния на жизнеспособность и функциональную активность нейронных сетей первичных культур гиппокампа. Продемонстрированы нейропротекторные свойства гиперэкспрессии BDNF при моделировании гипоксии in vitro.

Заключение. Разработанный вирус, содержащий последовательность гена BDNF, повышает экспрессию BDNF нейронами головного мозга, что позволяет снизить гибель нервных клеток при моделировании гипоксии in vitro.генно-инженерные конструкты; аденоассоциированные вирусные векторы; нейротрофический фактор головного мозга; BDNF; ишемия головного мозга; гипоксия головного мозга; первичные культуры клеток гиппокампа; нейропротекция.

1. Chen A., Xiong L.J., Tong Y., Mao M. The neuroprotective roles of BDNF in hypoxic ischemic brain injury. Biomed Rep 2013; 1(2): 167–176, https://doi.org/10.3892/br.2012.48.
2. Harris N.M., Ritzel R., Mancini N.S., Jiang Y., Yi X., Manickam D.S., Banks W.A., Kabanov A.V., McCullough L.D., Verma R. Nano-particle delivery of brain derived neurotrophic factor after focal cerebral ischemia reduces tissue injury and enhances behavioral recovery. Pharmacol Biochem Behav 2016; 150–151: 48–56, https://doi.org/10.1016/j.pbb.2016.09.003.
3. Kotlęga D., Peda B., Zembroń-Łacny A., Gołąb-Janowska M., Nowacki P. The role of brain-derived neurotrophic factor and its single nucleotide polymorphisms in stroke patients. Neurol Neurochir Pol 2017; 51(3): 240–246, https://doi.org/10.1016/j.pjnns.2017.02.008.
4. Zhao H., Alam A., San C.Y., Eguchi S., Chen Q., Lian Q., Ma D. Molecular mechanisms of brain-derived neurotrophic factor in neuro-protection: recent developments. Brain Res 2017; 1665: 1–21, https://doi.org/10.1016/j.brainres.2017.03.029.
5. Douglas-Escobar M., Rossignol C., Steindler D., Zheng T., Weiss M.D. Neurotrophin-induced migration and neuronal differentiation of multipotent astrocytic stem cells in vitro. PLoS One 2012; 7(12): e51706, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0051706.
6. Skaper S.D. Neurotrophic factors: an overview. Methods Mol Biol 2018; 1727: 1–17, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7571-6_1.
7. Martin J.L., Finsterwald C. Cooperation between BDNF and glutamate in the regulation of synaptic transmission and neuronal development. Commun Integr Biol 2011; 4(1): 14–16, https://doi.org/10.4161/cib.13761.
8. Rose C.R., Blum R., Kafitz K.W., Kovalchuk Y., Konnerth A. From modulator to mediator: rapid effects of BDNF on ion channels. BioEssays 2004; 26(11): 1185–1194, https://doi.org/10.1002/bies.20118.
9. Сunha C., Brambilla R., Tomas K.L. A simple role for BDNF in learning and memory? Front Mol Neurosci 2010; 3: 1, https://doi.org/10.3389/neuro.02.001.2010.
10. Kowiański P., Lietzau G., Czuba E., Waśkow M., Steliga A., Moryś J. BDNF: a key factor with multipotent impact on brain signaling and synaptic plasticity. Cell Mol Neurobiol 2018; 38(3): 579–593, https://doi.org/10.1007/s10571-017-0510-4.
11. Vedunova М.V., Sakharnova Т.А., Mitroshina E.V., Shishkina T.V., Astrakhanova T.A., Mukhina I.V. Antihypoxic and neuroprotective properties of BDNF and GDNF in vitro and in vivo under hypoxic conditions. Sovremennye tehnologii v medicine 2014; 6(4): 38–47.
12. Zhang Y., Pardridge W.M. Neuroprotection in transient focal brain ischemia after delayed intravenous administration of brain-derived neurotrophic factor conjugated to a blood-brain barrier drug targeting system. Stroke 2001; 32(6): 1378–1384, https://doi.org/10.1161/01.str.32.6.1378.
13. Neumann J.T., Thompson J.W., Raval A.P., Cohan C.H., Koronowski K.B., Perez-Pinzon M.A. Increased BDNF protein expression after ischemic or PKC epsilon preconditioning promotes electrophysiologic changes that lead to neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab 2015; 35(1): 121–130, https://doi.org/10.1038/jcbfm.2014.185.
14. Huang W., Meng F., Cao J., Liu X., Zhang J., Li M. Neuroprotective role of exogenous brain-derived neurotrophic factor in hypoxia-hypoglycemia-induced hippocampal neuron injury via regulating Trkb/MiR134 signaling. J Mol Neurosci 2017; 62(1): 35–42, https://doi.org/10.1007/s12031-017-0907-z.
15. Berretta A., Tzeng Y.C., Clarkson A.N. Post-stroke recovery: the role of activity-dependent release of brain-derived neurotrophic factor. Expert Rev Neurother 2014; 14(11): 1335–1344, https://doi.org/10.1586/14737175.2014.969242.
16. Mang C.S., Campbell K.L., Ross C.J., Boyd L.A. Promoting neuroplasticity for motor rehabilitation after stroke: considering the effects of aerobic exercise and genetic variation on brain-derived neurotrophic factor. Phys Ther 2013; 93(12): 1707–1716, https://doi.org/10.2522/ptj.20130053.
17. Liu S., Sandner B., Schackel T., Nicholson L., Chtarto A., Tenenbaum L., Puttagunta R., Müller R., Weidner N., Blesch A. Regulated viral BDNF delivery in combination with Schwann cells promotes axonal regeneration through capillary alginate hydrogels after spinal cord injury. Acta Biomater 2017; 60: 167–180, https://doi.org/10.1016/j.actbio.2017.07.024.
18. Kimura A., Namekata K., Guo X., Harada C., Harada T. Neuroprotection, growth factors and BDNF-TrkB signalling in retinal degeneration. Int J Mol Sci 2016; 17(9): 1584, https://doi.org/10.3390/ijms17091584.
19. Igarashi T., Miyake K., Kobayashi M., Kameya S., Fujimoto C., Nakamoto K., Takahashi H., Igarashi T., Miyake N., Iijima O., Hirai Y., Shimada T., Okada T., Takahashi H. Tyrosine triple mutated AAV2-BDNF gene therapy in a rat model of transient IOP elevation. Mol Vis 2016; 22: 816–826.
20. Katsu-Jiménez Y., Loría F., Corona J.C., Díaz-Nido J. Gene transfer of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) prevents neurodegeneration triggered by FXN deficiency. Mol Ther 2016; 24(5): 877–889, https://doi.org/10.1038/mt.2016.32.
21. Iwasaki Y., Negishi T., Inoue M., Tashiro T., Tabira T., Kimura N. Sendai virus vector-mediated brain-derived neurotrophic factor expression ameliorates memory deficits and synaptic degeneration in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Neurosci Res 2012; 90(5): 981–989, https://doi.org/10.1002/jnr.22830.
22. Dekeyster E., Geeraerts E., Buyens T., Van den Haute C., Baekelandt V., De Groef L., Salinas-Navarro M., Moons L. Tackling glaucoma from within the brain: an unfortunate interplay of BDNF and TrkB. PLoS One 2015; 10(11): e0142067, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0142067.
23. Yu S.J., Tseng K.Y., Shen H., Harvey B.K., Airavaara M., Wang Y. Local administration of AAV-BDNF to subventricular zone induces functional recovery in stroke rats. PLoS One 2013; 8(12): e81750, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0081750.
24. Vedunova M.V., Mishchenko T.A., Mitroshina E.V., Mukhina I.V. TrkB-mediated neuroprotective and antihypoxic properties of brain-derived neurotrophic factor. Oxid Med Cell Longev 2015; 2015: 453901, https://doi.org/10.1155/2015/453901.
25. Zakharov Yu.N., Korotchenko S.A., Kalintseva Ya.I., Potanina A.V., Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Mukhina I.V. Fluorescence analysis of the metabolic activity patterns of a neuronal-glial network. Journal of Optical Technology 2012; 79(6): 348–351, https://doi.org/10.1364/jot.79.000348.
26. Pimashkin A., Kastalskiy I., Simonov A., Koryagina E., Mukhina I., Kazantsev V. Spiking signatures of spontaneous activity bursts in hippocampal cultures. Front Comput Neurosci 2011; 5: 46, https://doi.org/10.3389/fncom.2011.00046.
27. Shirokova О.М., Frumkina L.Е., Vedunova М.V., Mitroshina Е.V., Zakharov Y.N., Khaspekov L.G., Mukhina I.V. Morphofunctional patterns of neuronal network developing in dissociated hippocampal cell cultures. Sovremennye tehnologii v medicine 2013; 2: 6–13.
28. Агрба Е.А., Мухина И.В. Пространственно-времен­ная характеристика нейросетевой активности первичных культур гиппокампа. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2013; 4(1): 139–144.
29. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М., Захаров Ю.Н., Калинцева Я.И., Мухина И.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2011; 2(2): 283–286.
30. Ramos-Cejudo J., Gutiérrez-Fernández M., Otero-Ortega L., Rodríguez-Frutos B., Fuentes B., Vallejo-Cremades M.T., Hernanz T.N., Cerdán S., Díez-Tejedor E. Brain-derived neurotrophic factor administration mediated oligodendrocyte differentiation and myelin formation in subcortical ischemic stroke. Stroke 2015; 46(1): 221–228, https://doi.org/10.1161/strokeaha.114.006692.
31. Hernandez-Torres V., Gransee H.M., Mantilla C.B., Wang Y., Zhan W.Z., Sieck G.C. BDNF effects on functional recovery across motor behaviors after cervical spinal cord injury. J Neurophysiol 2017; 117(2): 537–544, https://doi.org/10.1152/jn.00654.2016.
32. Ведунова М.В., Мищенко Т.А., Шишкина Т.В., Мухина И.В. Способ частичного восстановления функ­циональной активности нейронных сетей in vitro в условиях их значительного повреждения. Патент РФ 2594065. 2016.

Mitroshina E.V., Epifanova E.A., Mishchenko T.A., Yarkov R.S., Babaev A.A., Vedunova M.V. Application of the AAV-Syn-BDNF-EGFP Virus Vector as a Neuroprotective Agent in Modeling Hypoxia in vitro. Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(2): 47, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.2.05