Нейротропное действие карбамилированного дарбэпоэтина на модели первичной культуры гиппокампа

Активация церебральной эритропоэтиновой системы может служить перспективной стратегией для лечения различных нейродегенеративных и психоневрологических заболеваний благодаря запуску нейропротекторных механизмов и улучшению когнитивных функций. Отсутствие сведений о возможном нейротропном действии эритропоэтина снижает возможность использования мозгового рецептора к эритропоэтину в качестве терапевтической мишени при нейродегенеративных заболеваниях, связанных с гипоксией и воспалением.

Цель исследования — изучение влияния агониста эритропоэтинового рецептора карбамилированного дарбэпоэтина (CdEpo) на морфофункциональные характеристики нейрон-глиальных сетей первичной культуры гиппокампа мышей в условиях нормоксии.

Материалы и методы. Для изучения влияния стимуляции эритропоэтинового рецептора на функциональную активность нейрон-глиальных сетей гиппокампа использовали первичные культуры из диссоциированных клеток гиппокампа, полученных из эмбрионов (Е18) мышей линии C57BL/6. Эксперименты проводились на 18–23-й дни развития культуры in vitro. Длительность воздействия CdEpo (100 нг/мл) составила 24 ч. Функциональные изменения оценивали по электрической и метаболической активности клеток культуры с использованием методов локальной фиксации потенциала (patch clamp), мультиэлектродной регистрации биоэлектрической активности нейронных сетей и кальциевого имиджинга соответственно. Морфологические характеристики клеток первичной культуры гиппокампа исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Результаты. Воздействие CdEpo в течение суток на клетки первичной культуры гиппокампа не влияло на частоту спонтанных одиночных потенциалов действия, спонтанную пачечную активность клеток, на характеристики потенциалов действия нейронов (амплитуду фазы деполяризации, пороговый потенциал, амплитуду фазы гиперполяризации), емкость мембраны; не оказывало воздействия на биоэлектрические параметры сетевой активности нейронов (число спайков в составе сетевой пачки, длительность сетевой пачки и межпачечный интервал), кальциевую активность нейронов и глиальных клеток, определяемую по параметрам длительности и частоты спонтанных кальциевых осцилляций. На ультраструктурном уровне под влиянием CdEpo не изменялось количество зрелых асимметричных синаптических контактов, но происходил морфогенез внутренней структуры дендритных шипиков: повышалось число шипиков с эндоплазматическим ретикулумом и/или шипиковым аппаратом внутри, что является уникальным явлением для модели первичной культуры гиппокампа.

Заключение. На модели первичной культуры гиппокампа выявлено отсутствие нейротропного действия CdEpo — по параметрам биоэлектрической активности одиночных нейронов, нейронных сетей, а также активности астроцитарных сетей — по параметрам изменения концентрации внутриклеточного кальция (кальциевых осцилляций) в условиях нормоксии. В то же время CdEpo вызывает в некоторых нейронах изменение внутренней организации дендритных шипиков с появлением в них шипикового аппарата. Отсутствие влияния CdEpo на работу интактных нейронов и глии свидетельствует об относительной безопасности использования данной молекулы в терапевтических целях в качестве цитопротектора для тканей мозга.

1. Hernández C.C., Burgos C.F., Gajardo A.H., Silva-Grecchi T., Gavilan J., Toledo J.R., Fuentealba J. Neuroprotective effects of erythropoietin on neurodegenerative and ischemic brain diseases: the role of erythropoietin receptor. Neural Regen Res 2017; 12(9): 1381–1389, https://doi.org/10.4103/1673-5374.215240.
2. Ponce L.L., Navarro J.C., Ahmed O., Robertson C.S. Erythropoietin neuroprotection with traumatic brain injury. Pathophysiology 2013; 20(1): 31–38, https://doi.org/10.1016/j.pathophys.2012.02.005.
3. Alnaeeli M., Wang L., Piknova B., Rogers H., Li X., Noguchi C.T. Erythropoietin in brain development and beyond. Anat Res Int 2012; 2012; 953264, https://doi.org/10.1155/2012/953264.
4. Chavez J.C., Baranova O., Lin J., Pichiule P. The transcriptional activator hypoxia inducible factor 2 (HIF-2/EPAS-1) regulates the oxygen-dependent expression of erythropoietin in cortical astrocytes. J Neurosci 2006; 26(37): 9471–9481, https://doi.org/10.1523/jneurosci.2838-06.2006.
5. Khan A.I., Coldewey S.M., Patel N.S., Rogazzo M., Collino M., Yaqoob M.M., Radermacher P., Kapoor A., Thiemermann C. Erythropoietin attenuates cardiac dysfunction in experimental sepsis in mice via activation of the β-common receptor. Dis Model Mech 2013; 6(4): 1021–1030, https://doi.org/10.1242/dmm.011908.
6. Leist M., Ghezzi P., Grasso G., Bianchi R., Villa P., Fratelli M., Savino C., Bianchi M., Nielsen J., Gerwien J., Kallunki P., Larsen A.K., Helboe L., Christensen S., Pedersen L.O., Nielsen M., Torup L., Sager T., Sfacteria A., Erbayraktar S., Erbayraktar Z., Gokmen N., Yilmaz O., Cerami-Hand C., Xie Q.W., Coleman T., Cerami A., Brines M. Derivatives of erythropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science 2004; 305(5681): 239–242, https://doi.org/10.1126/science.1098313.
7. Brines M., Cerami A. Emerging biological roles for erythropoietin in the nervous system. Nat Rev Neurosci 2005; 6(6): 484–494, https://doi.org/10.1038/nrn1687.
8. Bohr S., Patel S.J., Vasko R., Shen K., Iracheta-Vellve A., Lee J., Bale S.S., Chakraborty N., Brines M., Cerami A., Berthiaume F., Yarmush M.L. Modulation of cellular stress response via the erythropoietin/CD131 heteroreceptor complex in mouse mesenchymal-derived cells. J Mol Med 2015; 93(2): 199–210, https://doi.org/10.1007/s00109-014-1218-2.
9. Elliott S., Busse L., Bass M.B., Lu H., Sarosi I., Sinclair A.M., Spahr C., Um M., Van G., Begley C.G. Anti-Epo receptor antibodies do not predict Epo receptor expression. Blood 2006; 107(5): 1892–1895, https://doi.org/10.1182/blood-2005-10-4066.
10. Kirkeby A., van Beek J., Nielsen J., Leist M., Helboe L. Functional and immunochemical characterisation of different antibodies against the erythropoietin receptor. J Neurosci Methods 2007; 164(1): 50–58, https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2007.03.026.
11. Жученко М.А., Серебрякова М.В., Серегин Ю.А., Че­ре­пушкин С.А., Лобанова Н.В., Клишин А.А., Волог­жанникова А.А., Казаков А.С., Пермяков С.Е. Карбамили­рованный дарбэпоэтин альфа: структура и свойства. Био­технология 2017; 33(4): 28–43, https://doi.org/10.21519/0234-2758-2017-33-4-28-43.
12. Shirokova О.М., Frumkina L.Е., Vedunova М.V., Mitroshina Е.V., Zakharov Y.N., Khaspekov L.G., Mukhina I.V. Morphofunctional patterns of neuronal network developing in dissociated hippocampal cell cultures. Sovremennye tehnologii v medicine 2013; 5(2): 6–13.
13. Zakharov Y.N., Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Korotchenko S.A., Kalintseva Y.I., Mukhina I.V., Potanina A.V. Fluorescence analysis of the metabolic activity patterns of a neuronal–glial network. Journal of Optical Technology 2012; 79(6): 348, https://doi.org/10.1364/jot.79.000348.
14. Pimashkin A., Gladkov A., Mukhina I., Kazantsev V. Adaptive enhancement of learning protocol in hippocampal cultured networks grown on multielectrode arrays. Front Neural Circuits 2013; 7, https://doi.org/10.3389/fncir.2013.00087.
15. Ding J., Wang J., Li Q.Y., Yu J.Z., Ma C.G., Wang X., Lu C.Z., Xiao B.G., Neuroprotection and CD131/GDNF/AKT pathway of carbamylated erythropoietin in hypoxic neurons. Mol Neurobiol 2017; 54(7): 5051–5060, https://doi.org/10.1007/s12035-016-0022-0.
16. Majewska A., Brown E., Ross J., Yuste R. Mechanisms of calcium decay kinetics in hippocampal spines: role of spine calcium pumps and calcium diffusion through the spine neck in biochemical compartmentalization. J Neurosci 2000; 20(5): 1722–1734, https://doi.org/10.1523/jneurosci.20-05-01722.2000.

Shirokova O.M., Sokolov R.A., Korotchenko S.A., Pershin V.I., Ermin K.V., Glyavina M.M., Zhuchenko M.A., Andreeva N.N., Shchelchkova N.A., Mukhina I.V. Neurotropic Effect of Carbamylated Darbepoietin on the Model of Primary Hippocampal Culture. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 87, https://doi.org/10.17691/stm2019.11.4.10