Разработка двухслойного пористого скаффолда на основе хряща перегородки носа свиньи для ортопедии

Цель исследования — получение конструкции на основе пластины хряща носовой перегородки, обеспечивающей нужную дифференцировку клеток в разных слоях для замещения глубокого остеохондрального дефекта; разработка алгоритма последовательности химических и физических воздействий для создания неиммуногенной, двухслойной пористой структуры с нужными упруго-механическими свойствами.

Материалы и методы. Пластины из гиалинового хряща носовой перегородки свиньи, покрытые сверху надхрящницей, подвергались многостадийной обработке, включающей заморозку, выдерживание в гипотоническом растворе солей (образцы типа I); трипсинизацию, точечное ИК-лазерное воздействие, повторную трипсинизацию (образцы типа II); стабилизирующее действие сшивающих агентов — глицеринового альдегида/рибозы в кислой среде — отмывку (образцы типа III).

Для всех типов образцов:

1) установлены параметры стабильности (температура денатурации коллагена с помощью термического анализа и модуль Юнга с помощью механического анализа);

2) определены основные морфологические особенности с помощью световой и поляризационной микроскопии с классическими окрасками препаратов и нелинейной оптической микроскопии в режиме генерации второй гармоники.

Результаты. У образцов типа I термические, механические и морфологические свойства практически не отличались от свойств исходной системы носовой перегородки. Значительная часть клеток имела разрушенные мембраны.

В образцах типа II термическая стабильность коллагенового каркаса была существенно снижена; модуль Юнга снизился более чем в 4 раза по сравнению с образцами типа I. Коллагеновая структура гиалинового хряща оказалась дезорганизована, тем не менее сохранились морфологические отличия гиалиновой части и надхрящницы. Произошла почти полная децеллюляризация матрикса конструкции. Последовательное воздействие лазерного излучения и трипсина привело к образованию в матрице неполнослойных отверстий с диаметром ~100 мкм.

В образцах типа III увеличились как термическая стабильность коллагенового каркаса, так и модуль Юнга (E). Глицериновый альдегид действовал более эффективно, чем рибоза, причем значение Е достигло величины, характерной для интактного гиалинового хряща. Волокна коллагена в образцах типа III были более толстые, чем в образцах типов I и II. Сохранились морфологические отличия гиалиновой части и надхрящницы и несквозные отверстия.

Заключение. В результате последовательных обработок солями, трипсином, ИК-лазерным излучением и нетоксичными сшивающими агентами пластина хряща носовой перегородки образует пористую бесклеточную конструкцию, которая состоит из двух слоев, образованных волокнами коллагена типа I (из надхрящницы) и типа II (из гиалиновой части). Для данной конструкции можно задавать стабильность, механические свойства и размеры полостей для заселения клеткам. Это дает возможность использовать конструкцию для замены дефектов суставного хряща.

1. Cheng A., Schwartz Z., Kahn A., Li X., Shao Z., Sun M., Ao Y., Boyan B.D., Chen H. Advances in porous scaffold design for bone and cartilage tissue engineering and regeneration. Tissue Eng Part B Rev 2019; 25(1): 14–29, https://doi.org/10.1089/ten.teb.2018.0119.
2. Wang M., Yuan Z., Ma N., Hao C., Guo W., Zou G., Zhang Y., Chen M., Gao S., Peng J., Wang A., Wang Y., Sui X., Xu W., Lu S., Liu S., Guo Q. Advances and prospects in stem cells for cartilage regeneration. Stem Cells Int 2017; 2017: 4130607, https://doi.org/10.1155/2017/4130607.
3. Izadifar Z., Chen X., Kulyk W. Strategic design and fabrication of engineered scaffolds for articular cartilage repair. J Funct Biomater 2012; 3(4): 799–838, https://doi.org/10.3390/jfb3040799.
4. Cheng C.W., Solorio L.D., Alsberg E. Decellularized tissue and cell-derived extracellular matrices as scaffolds for orthopaedic tissue engineering. Biotechnol Adv 2014; 32(2): 462–484, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.12.012.
5. Yang Q., Peng J., Guo Q., Huang J., Zhang L., Yao J., Yang F., Wang S., Xu W., Wang A., Lu S. A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials 2008; 29(15): 2378–2387, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.01.037.
6. Zhang Y., Liu S., Guo W., Wang M., Hao C., Gao S., Zhang X., Li X., Chen M., Jing X., Wang Z., Peng J., Lu S., Guo Q. Human umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells combined with an acellular cartilage extracellular matrix scaffold improve cartilage repair compared with microfracture in a caprine model. Osteoarthritis Cartilage 2018; 26(7): 954–965, https://doi.org/10.1016/j.joca.2018.01.019.
7. Graham M.E., Gratzer P.F., Bezuhly M., Hong P. Development and characterization of decellularized human nasoseptal cartilage matrix for use in tissue engineering. Laryngoscope 2016; 126(10): 2226–2231, https://doi.org/10.1002/lary.25884.
8. Jia S., Zhang T., Xiong Z., Pan W., Lui J., Sun W. In vivo evaluation of a novel oriented scaffold-BMSC construct for enhancing full-thickness articular cartilage repair in a rabbit model. PLoS One 2015; 10(12): e0145667, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145667.
9. Luo R., Eswaramoorthy K.J., Mulhall D.J., Kelly D.J. Decellularization of porcine articular cartilage explants and their subsequent repopulation with human chondroprogenitor cells. J Mech Behav Biomed Mater 2015; 55: 21–31, https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2015.10.002.
10. Bowland P., Ingham E., Jennings L., Fisher J. Review of the biomechanics and biotribology of osteochondral grafts used for surgical interventions in the knee. Proc Inst Mech Eng H 2015; 229(12): 879–888, https://doi.org/10.1177/0954411915615470.
11. Wang K.H., Wan R., Chiu L.H., Tsai Y.H., Fang C.L., Bowley J.F., Chen K.C., Shih H.N., Lai W.T. Effects of collagen matrix and bioreactor cultivation on cartilage regeneration of a fullthickness critical-size knee joint cartilage defects with subchondral bone damage in a rabbit model. PLoS One 2018; 13(5): e0196779, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196779.
12. Rowland R., Colucci L.A., Guilak F. Fabrication of anatomically-shaped cartilage constructs using decellularized cartilage-derived matrix scaffolds. Biomaterials 2016; 91: 57–72, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.03.012.
13. Барановский Д.С., Демченко А.Г., Оганесян Р.В., Лебедев Г.В., Берсенева Д.А., Балясин М.В., Паршин В.Д., Люндуп А.В. Получение бесклеточного матрикса хряща трахеи для тканеинженерных конструкций. Вестник РАМН 2017; 72(4): 254–260, https://doi.org/10.15690/vramn723.
14. Rowland C.R., Glass C.A., Ettyreddy A.R., Gloss C.C., Matthews J.R.L., Huynh N.P.T., Guilak F. Regulation of decellularized tissue remodeling via scaffold-mediated lentiviral delivery in anatomically-shaped osteochondral constructs. Biomaterials 2018; 177: 161–175, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.04.049.
15. Yang Q., Peng J., Lu S.B., Guo Q.Y., Zhao B., Zhang L., Wang A.Y., Xu W.J., Xia Q., Ma X.L., Hu Y.C., Xu B.S. Evaluation of an extracellular matrix-derived acellular biphasic scaffold/cell construct in the repair of a large articular high-load-bearing osteochondral defect in a canine model. Chin Med J (Engl) 2011; 124(23): 3930–3938.
16. Hernigou J., Vertongen P., Chahidi E., Kyriakidis T., Dehoux J.P., Crutzen M., Boutry S., Larbanoix L., Houben S., Gaspard N., Koulalis D., Rasschaert J. Effects of press-fit biphasic (collagen and HA/βTCP) scaffold with cell-based therapy on cartilage and subchondral bone repair knee defect in rabbits. Intern Orthop 2018; 42(7): 1755–1767, https://doi.org/10.1007/s00264-018-3999-3.
17. Bernhardt A., Paul B., Gelinsky M. Biphasic scaffolds from marine collagens for regeneration of osteochondral defects. Mar Drugs 2018; 16(3): 91–97, https://doi.org/10.3390/md16030091.
18. Xu Y., Guo X., Yang Sh., Li L., Zhang P., Sun W., Liu C., Mi S. Construction of bionic tissue engineering cartilage scaffold based on three-dimensional printing and oriented frozen technology. J Biomed Mater Res Part A 2018; 106(6): 1664–1676, https://doi.org/10.1002/jbm.a.36368.
19. Zakharkina O.L., Sergeeva E.A., Kirillin M.Yu., Ignatieva N.Y. Analysis of laser-induced modification of collagen structure using nonlinear optical microscopy. Quantum Electron 2020; 50(1): 76–80, https://doi.org/10.1070/qel17214.
20. Sviridov A.P., Zakharkina O.L., Ignatieva N.Y., Vorobieva N.N., Bagratashvili N.V., Plyakin V.A., Kulik I.O., Sarukhanyan O.O., Minaev V.P., Lunin V.V., Bagratashvili V.N. Ex vivo laser thermoplasty of whole costal cartilages. Lasers Surg Med 2014; 46(4): 302–309, https://doi.org/10.1002/lsm.22233.
21. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Averkiev S.V., Maiorova A.F., Bagratashvili V.N., Sobol E.N. DSC investigation of connective tissues treated by IR-laser radiation. Thermochim Acta 2004; 422(1–2): 43–48, https://doi.org/10.1016/j.tca.2004.04.030.
22. Лазерная инженерия хрящей. Под ред. В.Н. Багра­ташвили, Э.Н. Соболя, А.Б. Шехтера. М: ФИЗМАТЛИТ; 2006.
23. Schmidt M.B., Mow V.C., Chun L.E., Eyre D.R. Effects of proteoglycan extraction on the tensile behavior of articular cartilage. J Orthop Res 1990; 8(3): 353–363, https://doi.org/10.1002/jor.1100080307.
24. Bailey A.J., Paul R.G., Knott L. Mechanisms of maturation and ageing of collagen. Mech Ageing Dev 1998; 106(1–2): 1–56, https://doi.org/10.1016/s0047-6374(98)00119-5.
25. Danilov N.A., Ignatieva N.Yu., Iomdina E.N., Semenova S.A., Rudenskaya G.N., Grokhovskaya T.E., Lunin V.V. Stabilization of scleral collagen by glycerol aldehyde cross-linking. Biochim Biophys Acta 2008; 1780(5): 764–772, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2008.01.014.
26. Sung H.W., Chang Y., Chiu C.T., Chen C.N., Liang H.C. Crosslinking characteristics and mechanical properties of a bovine pericardium fixed with a naturally occurring crosslinking agent. J Biomed Mater Res 1999; 47(2): 116–126, https://doi.org/10.1002/(sici)1097-4636(199911)47:2116::aid-jbm23.0.co;2-j.
27. Bai P., Phua K., Hardt T., Cernadas M., Brodsky B. Glycation alters collagen fibril organization. Connect Tissue Res 1992; 28(1–2): 1–12, https://doi.org/10.3109/03008209209014224.
28. Lee K.W., Simpson G., Ortwerth B. A systematic approach to evaluate the modification of lens proteins by glycation-induced crosslinking. Biochim Biophys Acta 1999; 1453(1): 141–151, https://doi.org/10.1016/s0925-4439(98)00097-0.

Ignatieva N.Yu., Zakharkina О.L., Sergeeva Е.А., Serezhnikova N.B., Faizullin А.L., Shekhter А.B. Development of a Two-Layer Porous Scaffold Based on Porcine Nasal Septal Cartilage for Orthopedics. Sovremennye tehnologii v medicine 2021; 13(4): 48, https://doi.org/10.17691/stm2021.13.4.05