FLIM-имиджинг автофлуоресценции НАД(Ф)Н Т-клеток в лимфатических узлах для оценки эффективности анти-CTLA-4-иммунотерапии

Основными проблемами иммунотерапии опухолей являются отсутствие надежных биомаркеров, позволяющих заранее определять индивидуальную восприимчивость пациентов к лечению, а также недостаточные знания о механизмах резистентности.

Биомаркеры на основе автофлуоресценции метаболических коферментов в иммунных клетках могут стать новым мощным предиктором раннего ответа опухоли на лечение, а оптический метод FLIM — инструментом прогнозирования эффективности иммунотерапии, позволяющим сохранять пространственную структуру образца и получать данные о метаболическом статусе иммунных клеток в режиме реального времени.

Цель работы — исследование методом метаболического имиджинга автофлуоресценции метаболического кофермента НАД(Ф)Н в иммунных клетках свежевыделенных лимфатических узлов как потенциального маркера для оценки раннего ответа на иммунотерапию.

Материалы и методы. Исследование проводили на мышах линии C57Bl/6 FoxP3-EGFP с меланомой B16F0, привитой вблизи пахового лимфоузла. Мышам вводили антитела к CTLA-4 (Bio X Cell, США) по 250 мкг на мышь, внутрибрюшинно на 7-, 8-, 11- и 12-й дни роста опухоли. FLIM-изображения в канале кофермента никотинамидадениндинуклеотида (фосфата) — НАД(Ф)Н (возбуждение — 375 нм, регистрация — 435–485 нм) получали с помощью флуоресцентного конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 (Carl Zeiss, Германия), оснащенного модулем FLIM Simple-Tau 152 TCSPC (Becker & Hickl GmbH, Германия). Проточную цитометрию проводили с использованием клеточного сортера BD FACSAria III (BD Biosciences, США).

Результаты. Иммунотерапия чекпоинт-ингибиторами приводила к выраженным метаболическим перестройкам в Т-клетках свежевыделенных лимфоузлов у мышей-респондеров с торможением роста опухоли. Данные FLIM-изображений НАД(Ф)Н свидетельствовали об увеличении свободной фракции НАДН α₁, вклада формы, связанной с гликолизом, для обеспечения высоких потребностей активированных Т-клеток и синтеза провоспалительных цитокинов. Напротив, у мышей-нереспондеров с прогрессирующей опухолью наблюдались низкие значения отношения свободной фракции к связанной α₁/α₂, что может быть связано с механизмами резистентности к терапии.

Ответ на иммунотерапию был верифицирован данными по экспрессии активационных и пролиферативных маркеров, полученными с помощью проточной цитометрии. Мы наблюдали увеличение продукции провоспалительного цитокина IFN-ã в эффекторных Т-клетках у мышей-респондеров по сравнению с контролем (без лечения) и нереспондерами. Кроме того, зарегистрировано повышение экспрессии поверхностных активационных маркеров CD25 и CD69 по сравнению с контролем.

Заключение. Использование FLIM-метода позволило продемонстрировать, что автофлуоресценция кофермента НАД(Ф)Н чувствительна к ответу на чекпоинт-иммунотерапию и может быть использована в качестве надежного маркера эффективности ответа на лечение.

1. Huang A.C., Zappasodi R. A decade of checkpoint blockade immunotherapy in melanoma: understanding the molecular basis for immune sensitivity and resistance. Nat Immunol 2022; 23(5): 660–670, https://doi.org/10.1038/s41590-022-01141-1.
2. Wolchok J.D., Chiarion-Sileni V., Gonzalez R., Grob J.J., Rutkowski P., Lao C.D., Cowey C.L., Schadendorf D., Wagstaff J., Dummer R., Ferrucci P.F., Smylie M., Butler M.O., Hill A., Márquez-Rodas I., Haanen J.B.A.G., Guidoboni M., Maio M., Schöffski P., Carlino M.S., Lebbé C., McArthur G., Ascierto P.A., Daniels G.A., Long G.V., Bas T., Ritchings C., Larkin J., Hodi F.S. Long-term outcomes with nivolumab plus ipilimumab or nivolumab alone versus ipilimumab in patients with advanced melanoma. J Clin Oncol 2022; 40(2): 127–137, https://doi.org/10.1200/jco.21.02229.
3. Egen J.G., Ouyang W., Wu L.C. Human anti-tumor immunity: insights from immunotherapy clinical trials. Immunity 2020; 52(1): 36–54, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2019.12.010.
4. Bai R., Lv Z., Xu D., Cui J. Predictive biomarkers for cancer immunotherapy with immune checkpoint inhibitors. Biomark Res 2020; 8: 34, https://doi.org/10.1186/s40364-020-00209-0.
5. Янус Г.А., Иевлева А.Г., Суспицын Е.Н., Тюрин В.И., Бизин И.В., Горустович О.А., Ни В.И., Холматов М.М., Лайдус Т.А., Чуйнышена С.А., Алексахина С.Н., Имяни­тов Е.Н. Предиктивные маркеры ответа на блокаторы конт­рольных точек иммунного ответа. Сибирский онко­ло­гический журнал 2020; 19(4): 123–131, https://doi.org/10.21294/1814-4861-2020-19-4-123-131.
6. Lei Y., Li X., Huang Q., Zheng X., Liu M. Progress and challenges of predictive biomarkers for immune checkpoint blockade. Front Oncol 2021; 11: 617335, https://doi.org/10.3389/fonc.2021.617335.
7. Li Y.Z., Zhang H.M. Recent advances in primary resistance mechanisms against immune checkpoint inhibitors. Curr Opin Oncol 2022; 34(1): 95–106, https://doi.org/10.1097/cco.0000000000000802.
8. Leone R.D., Powell J.D. Metabolism of immune cells in cancer. Nat Rev Cancer 2020; 20: 516–531, https://doi.org/10.1038/s41568-020-0273-y.
9. Hu C., Xuan Y., Zhang X., Liu Y., Yang S., Yang K. Immune cell metabolism and metabolic reprogramming. Mol Biol Rep 2022; 49(10): 9783–9795, https://doi.org/10.1007/s11033-022-07474-2.
10. Kolenc O.I., Quinn K.P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal 2019; 30(6): 875–889, https://doi.org/10.1089/ars.2017.7451.
11. Shirshin E.A., Shirmanova M.V., Gayer A.V., Lukina M.M., Nikonova E.E., Yakimov B.P., Budylin G.S., Dudenkova V.V., Ignatova N.I., Komarov D.V., Yakovlev V.V., Becker W., Zagaynova E.V., Shcheslavskiy V.I., Scully M.O. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: the quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A 2022; 119(9): e2118241119, https://doi.org/10.1073/pnas.2118241119.
12. Datta R., Heaster T.M., Sharick J.T., Gillette A.A., Skala M.C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt 2020; 25(7): 1–43, https://doi.org/10.1117/1.jbo.25.7.071203.
13. Kalinina S., Freymueller C., Naskar N., von Einem B., Reess K., Sroka R., Rueck A. Bioenergetic alterations of metabolic redox coenzymes as NADH, FAD and FMN by means of fluorescence lifetime imaging techniques. Int J Mol Sci 2021; 22(11): 5952, https://doi.org/10.3390/ijms22115952.
14. Lukina M.M., Dudenkova V.V., Ignatova N.I., Druzhkova I.N., Shimolina L.E., Zagaynova E.V., Shirmanova M.V. Metabolic cofactors NAD(P)H and FAD as potential indicators of cancer cell response to chemotherapy with paclitaxel. Biochim Biophys Acta Gen Subj 2018; 1862(8): 1693–1700, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2018.04.021.
15. Kuznetsova D.S., Rodimova S.A., Gulin A., Reunov D., Bobrov N., Polozova A.V., Vasin A., Shcheslavskiy V.I., Vdovina N., Zagainov V.E., Zagaynova E.V. Metabolic imaging and secondary ion mass spectrometry to define the structure and function of liver with acute and chronic pathology. J Biomed Opt 2019; 25(1): 1–14, https://doi.org/10.1117/1.jbo.25.1.014508.
16. Hu L., Wang N., Cardona E., Walsh A.J. Fluorescence intensity and lifetime redox ratios detect metabolic perturbations in T cells. Biomed Opt Express 2020; 11(10): 5674–5688, https://doi.org/10.1364/boe.401935.
17. Heaster T.M., Humayun M., Yu J., Beebe D.J., Skala M.C. Autofluorescence imaging of 3D tumor-macrophage microscale cultures resolves spatial and temporal dynamics of macrophage metabolism. Cancer Res 2020; 80(23): 5408–5423, https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-20-0831.
18. Miskolci V., Tweed K.E., Lasarev M.R., Britt E.C., Walsh A.J., Zimmerman L.J., McDougal C.E., Cronan M.R., Fan J., Sauer J.D., Skala M.C., Huttenlocher A. In vivo fluorescence lifetime imaging of macrophage intracellular metabolism during wound responses in zebrafish. Elife 2022; 11: e66080, https://doi.org/10.7554/elife.66080.
19. Walsh A.J., Mueller K.P., Tweed K., Jones I., Walsh C.M., Piscopo N.J., Niemi N.M., Pagliarini D.J., Saha K., Skala M.C. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng 2021; 5(1): 77–88, https://doi.org/10.1038/s41551-020-0592-z.
20. Lemire S., Thoma O.M., Kreiss L., Völkl S., Friedrich O., Neurath M.F., Schürmann S., Waldner M.J. Natural NADH and FAD autofluorescence as label-free biomarkers for discriminating subtypes and functional states of immune cells. Int J Mol Sci 2022; 23(4): 2338, https://doi.org/10.3390/ijms23042338.
21. Izosimova A.V., Shirmanova M.V., Shcheslavskiy V.I., Sachkova D.A., Mozherov A.M., Sharonov G.V., Zagaynova E.V., Yuzhakova D.V. FLIM of NAD(P)H in lymphatic nodes resolves T-cell immune response to the tumor. Int J Mol Sci 2022; 23(24): 15829, https://doi.org/10.3390/ijms232415829.
22. Patton E.E., Mueller K.L., Adams D.J., Anandasabapathy N., Aplin A.E., Bertolotto C., Bosenberg M., Ceol C.J., Burd C.E., Chi P., Herlyn M., Holmen S.L., Karreth F.A., Kaufman C.K., Khan S., Kobold S., Leucci E., Levy C., Lombard D.B., Lund A.W., Marie K.L., Marine J.C., Marais R., McMahon M., Robles-Espinoza C.D., Ronai Z.A., Samuels Y., Soengas M.S., Villanueva J., Weeraratna A.T., White R.M., Yeh I., Zhu J., Zon L.I., Hurlbert M.S., Merlino G. Melanoma models for the next generation of therapies. Cancer Cell 2021; 39(5): 610–631, https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.01.011.
23. Izosimova A.V., Yuzhakova D.V., Skatova V.D., Volchkova L.N., Zagainova E.V., Chudakov D.M., Sharonov G.V. Deciphering repertoire of B16 melanoma reactive TCRs by immunization, in vitro restimulation and sequencing of IFNγ-secreting T cells. Int J Mol Sci 2021; 22(18): 9859, https://doi.org/10.3390/ijms22189859.
24. Yuzhakova D.V., Volchkova L.N., Pogorelyy M.V., Serebrovskaya E.O., Shagina I.A., Bryushkova E.A., Nakonechnaya T.O., Izosimova A.V., Zavyalova D.S., Karabut M.M., Izraelson M., Samoylenko I.V., Zagainov V.E., Chudakov D.M., Zagaynova E.V., Sharonov G.V. Measuring intratumoral heterogeneity of immune repertoires. Front Oncol 2020; 10: 512, https://doi.org/10.3389/fonc.2020.00512.
25. Zhigalova E.A., Izosimova A.I., Yuzhakova D.V., Volchkova L.N., Shagina I.A., Turchaninova M.A., Serebrovskaya E.O., Zagaynova E.V., Chudakov D.M., Sharonov G.V. RNA-seq-based TCR profiling reveals persistently increased intratumoral clonality in responders to anti-PD-1 therapy. Front Oncol 2020; 10: 385, https://doi.org/10.3389/fonc.2020.00385.
26. Fontenot J.D., Rasmussen J.P., Williams L.M., Dooley J.L., Farr A.G., Rudensky A.Y. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 2005; 22(3): 329–341, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.01.016.
27. Skala M.C., Riching K.M., Bird D.K., Gendron-Fitzpatrick A., Eickhoff J., Eliceiri K.W., Keely P.J., Ramanujam N. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. J Biomed Opt 2007; 12(2): 024014, https://doi.org/10.1117/1.2717503.
28. Waldman A.D., Fritz J.M., Lenardo M.J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nat Rev Immunol 2020; 20(11): 651–668, https://doi.org/10.1038/s41577-020-0306-5.
29. Liu Y., Zheng P. Preserving the CTLA-4 checkpoint for safer and more effective cancer immunotherapy. Trends Pharmacol Sci 2020; 41(1): 4–12, https://doi.org/10.1016/j.tips.2019.11.003.
30. Zheng K., Zheng X., Yang W. The role of metabolic dysfunction in T-cell exhaustion during chronic viral infection. Front Immunol 2022; 13: 843242, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.843242.
31. Seidel J.A., Otsuka A., Kabashima K. Anti-PD-1 and anti-CTLA-4 therapies in cancer: mechanisms of action, efficacy, and limitations. Front Oncol 2018; 8: 86, https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00086.
32. Pires da Silva I., Ahmed T., Reijers I.L.M., Weppler A.M., Betof Warner A., Patrinely J.R., Serra-Bellver P., Allayous C., Mangana J., Nguyen K., Zimmer L., Trojaniello C., Stout D., Lyle M., Klein O., Gerard C.L., Michielin O., Haydon A., Ascierto P.A., Carlino M.S., Lebbe C., Lorigan P., Johnson D.B., Sandhu S., Lo S.N., Blank C.U., Menzies A.M., Long G.V. Ipilimumab alone or ipilimumab plus anti-PD-1 therapy in patients with metastatic melanoma resistant to anti-PD-(L)1 monotherapy: a multicentre, retrospective, cohort study. Lancet Oncol 2021; 22(6): 836–847, https://doi.org/10.1016/s1470-2045(21)00097-8.
33. Zappasodi R., Serganova I., Cohen I.J., Maeda M., Shindo M., Senbabaoglu Y., Watson M.J., Leftin A., Maniyar R., Verma S., Lubin M., Ko M., Mane M.M., Zhong H., Liu C., Ghosh A., Abu-Akeel M., Ackerstaff E., Koutcher J.A., Ho P.C., Delgoffe G.M., Blasberg R., Wolchok J.D., Merghoub T. CTLA-4 blockade drives loss of Treg stability in glycolysis-low tumours. Nature 2021; 591(7851): 652–658, https://doi.org/10.1038/s41586-021-03326-4.
34. Zhou B., Gao Y., Zhang P., Chu Q. Acquired resistance to immune checkpoint blockades: the underlying mechanisms and potential strategies. Front Immunol 2021; 12: 693609, https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.693609.
35. Kishton R.J., Sukumar M., Restifo N.P. Metabolic regulation of T cell longevity and function in tumor immunotherapy. Cell Metab 2017; 26(1): 94–109, https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.06.016.

Izosimova A.V., Mozherov A.M., Shirmanova M.V., Shcheslavskiy V.I., Sachkova D.A., Zagaynova E.V., Sharonov G.V., Yuzhakova D.V. Fluorescence Lifetime Imaging of NAD(P)H T Cells Autofluorescence in the Lymphatic Nodes to Assess the Effectiveness of Anti-CTLA-4 Immunotherapy. Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(3): 5, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.3.01