Технология комбинированного выявления макрофагов и коллагеновых волокон в препаратах печени

Значимость оценки развития патологических изменений в печени как при проведении фундаментальных исследований, так и в диагностической практике обусловливает необходимость иметь в арсенале исследователя удобный способ оценки функционального состояния резидентных макрофагов и волокон соединительной ткани.

Цель исследования — оценить возможности технологии комбинированного гисто-иммуногистохимического выявления коллагеновых волокон соединительной ткани и резидентных макрофагов печени с использованием гистохимического красителя анилинового синего и доступных антител к микроглиальному маркеру — белку Iba-1.

Материалы и методы. Исследование проводили на образцах печени половозрелых крыс (n=6). Для окраски соединительной ткани использовали 2% водный раствор анилинового синего (Unisource Chemicals Pvt. Ltd., Индия). С целью выявления резидентных макрофагов печени применяли моноклональные кроличьи антитела к белку Iba-1 (клон JM36-62; ET1705-78; HuaBio, Китай), при этом использовали цинк-этанол-формальдегид в качестве фиксатора.

Результаты. Способ комбинированного окрашивания во всех исследованных образцах печени позволил выявить множество Iba-1-иммунопозитивных структур, морфологически соответствующих клеткам Купфера и макрофагам соединительной ткани, фонового окрашивания не наблюдалось. Окрашивание анилиновым синим в образцах печени было избирательным, равномерным и четким и позволило дифференцировать соединительную ткань во всех исследованных образцах. Исключение этапа теплового демаскирования не оказало негативного влияния на выявляемость макрофагов, позволило снизить вероятность неспецифического окрашивания волокон коллагена анилиновым синим и обеспечило общую сохранность тинкториальных свойств ткани печени.

Заключение. Представленный протокол комбинированного гисто-иммуногистохимического выявления клеток Купфера и волокон соединительной ткани, примененный на препаратах печени крысы, позволяет эффективно использовать морфометрический анализ и может быть востребован в патогистологических, клинических и доклинических исследованиях.

1. Wen Y., Lambrecht J., Ju C., Tacke F. Hepatic macrophages in liver homeostasis and diseases-diversity, plasticity and therapeutic opportunities. Cell Mol Immunol 2021; 18(1): 45–56, https://doi.org/10.1038/s41423-020-00558-8.
2. Setten E., Castagna A., Nava-Sedeño J.M., Weber J., Carriero R., Reppas A., Volk V., Schmitz J., Gwinner W., Hatzikirou H., Feuerhake F., Locati M. Understanding fibrosis pathogenesis via modeling macrophage-fibroblast interplay in immune-metabolic context. Nat Commun 2022; 13(1): 6499, https://doi.org/10.1038/s41467-022-34241-5.
3. Chaim F.D.M., Pascoal L.B., Chaim F.H.M., Palma B.B., Damázio T.A., da Costa L.B.E., Carvalho R., Cazzo E., Gestic M.A., Utrini M.P., Milanski M., Chaim E.A., Leal R.F. Histological grading evaluation of non-alcoholic fatty liver disease after bariatric surgery: a retrospective and longitudinal observational cohort study. Sci Rep 2020; 10(1): 8496, https://doi.org/10.1038/s41598-020-65556-2.
4. Gole L., Liu F., Ong K.H., Li L., Han H., Young D., Marini G.P.L., Wee A., Zhao J., Rao H., Yu W., Wei L. Quantitative image-based collagen structural features predict the reversibility of hepatitis C virus-induced liver fibrosis post antiviral therapies. Sci Rep 2023; 13(1): 6384, https://doi.org/10.1038/s41598-023-33567-4.
5. Matsuo M., Murata S., Hasegawa S., Hatada Y., Ohtsuka M., Taniguchi H. Novel liver fibrosis model in Macaca fascicularis induced by thioacetamide. Sci Rep 2020; 10(1): 2450, https://doi.org/10.1038/s41598-020-58739-4.
6. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М: Советская наука; 1957.
7. Вдовин В.М., Момот А.П., Орехов Д.А., Бобров И.П., Момот Д.А., Шахматов И.И., Красюкова В.О., Чернусь В.Е., Теряев В.В., Лычева Н.А., Москаленко С.В. Влияние экзогенного фибрин-мономера на гемостатический потенциал и образование фибрина в области дозированной травмы печени в эксперименте. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова 2020; 106(9): 1132–1143.
8. Никитина И.А., Разенкова В.А., Кирик О.В., Коржев­ский Д.Э. Выявление популяции клеток Купфера в печени крысы с использованием моноклональных и поликлональных антител к микроглиальному маркеру Iba-1. Медицинский академический журнал 2023; 23(1): 85–94, https://doi.org/10.17816/MAJ133649.
9. Grigorev I.P., Korzhevskii D.E. Current technologies for fixation of biological material for immunohistochemical analysis (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2018; 10(2): 156, https://doi.org/10.17691/stm2018.10.2.19.
10. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B., Tinevez J.Y., White D.J., Hartenstein V., Eliceiri K., Tomancak P., Cardona A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 2012; 9(7): 676–682, https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.
11. IJ Plugins. IJ Plugins Toolkit. URL: https://ij-plugins.sourceforge.net/plugins/toolkit.html.
12. GIMP — GNU Image Manipulation Program.
13. IJ Plugins. IJ Plugins: k-means Clustering. URL: https://ij-plugins.sourceforge.net/plugins/segmentation/k-means.html.
14. Iezzoni J.C. Diagnostic histochemistry in hepatic pathology. Semin Diagn Pathol 2018; 35(6): 381–389, https://doi.org/10.1053/j.semdp.2018.10.003.
15. Лебедева И.А., Муслимов С.А., Мусина Л.А. Экспе­риментальное моделирование процесса хронического воспаления и фиброза. Биомедицина 2013; 4: 114–123.
16. Dirven H., Vist G.E., Bandhakavi S., Mehta J., Fitch S.E., Pound P., Ram R., Kincaid B., Leenaars C.H.C., Chen M., Wright R.A., Tsaioun K. Performance of preclinical models in predicting drug-induced liver injury in humans: a systematic review. Sci Rep 2021; 11(1): 6403, https://doi.org/10.1038/s41598-021-85708-2.
17. Коржевский Д.Э., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Гусельникова В.В. Иммуногистохимическая характеристика нейронов черного вещества головного мозга человека. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Кор­сакова 2017; 117(4): 50–55, https://doi.org/10.17116/jnevro20171174150-55.
18. Shoulders M.D., Raines R.T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem 2009; 78: 929–958, https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.77.032207.120833.
19. Игнатьева Н.Ю., Данилов Н.А., Лунин В.В., Обрез­кова М.В., Аверкиев С.В., Чайковский Т.И. Изменение термодинамических характеристик денатурации колла­гена тканей глаза в результате неферментативной гликации. Вестник Московского университета 2007; 48(2): 75–79.
20. Meier Bürgisser G., Heuberger D.M., Giovanoli P., Calcagni M., Buschmann J. Delineation of the healthy rabbit kidney by immunohistochemistry — a technical note. Acta Histochem 2021; 123(4): 151701, https://doi.org/10.1016/j.acthis.2021.151701.
21. Baccetti B. Collagen and animal phylogeny. In: Bairati A., Garrone R. (eds). Biology of invertebrate and lower vertebrate collagens. NATO ASI Series. vol. 93. Springer, Boston, MA; 1985, https://doi.org/10.1007/978-1-4684-7636-1_2.
22. Antunes E., Oliveira P., Borrecho G., Oliveira M.J., Brito J., Aguas A., Martins dos S.J. Myocardial fibrosis in rats exposed to low frequency noise. Acta Cardiol 2013; 68(3): 241–245, https://doi.org/10.1080/ac.68.3.2983417.
23. Wagner J.M., Wallner C., Becerikli M., Reinkemeier F., von Glinski M., Sogorski A., Huber J., Dittfeld S., Becker K., Lehnhardt M., Dadras M., Behr B. Role of autonomous neuropathy in diabetic bone regeneration. Cells 2022; 11(4): 612, https://doi.org/10.3390/cells11040612.

Nikitina I.A., Razenkova V.A., Fedorova E.A., Kirik O.V., Korzhevskii D.E. Technology of Combined Identification of Macrophages and Collagen Fibers in Liver Samples. Sovremennye tehnologii v medicine 2024; 16(3): 24, https://doi.org/10.17691/stm2024.16.3.03