Разработка аналогов мембран внутреннего уха для экспериментальной оториноларингологии

А.А. Рябинин, О.С. Роговая, А.И. Крюков, Н.Л. Кунельская, Е.С. Янюшкина, В.В. Мищенко, М.М. Ильин, Е.А. Шершунова, В.В. Воеводин, С.В. Небогаткин, К.И. Романов, Е.А. Воротеляк

Ключевые слова: мембрана круглого окна; нейросенсорная тугоухость; пассивная диффузия дексаметазона; модель мембраны круглого окна; фибробласты человека; кератиноциты.

2025, том 17, номер 3, стр. 5.

DOI: https://doi.org/10.17691/stm2025.17.3.01

Полный текст статьи

html pdf

Аннотация
Список литературы
Как цитировать в References

Цель исследования — разработка и оценка модели мембраны круглого окна (мМКО) внутреннего уха человека, подходящей для репрезентативных исследований прохождения и цитотоксичности лекарственных препаратов.

Биологическая часть исследования. Для изготовления мМКО были протестированы различные варианты подложек, включая 2 варианта коллагеновых мембран Viscoll («ИМТЕК», Россия) и многосоставную мембрану G-Derm (G-DERM, Россия). На мембраны были посажены только эпителиальные клетки линии HaCaT в первом варианте и первичные дермальные фибробласты человека в комплексе с эпителиальными клетками линии HaCaT (последовательное нанесение) во втором варианте. Полученные мМКО оценены по морфологическим критериям при помощи гистохимических методов. В результате тестов было решено остановиться на мМКО, построенных на мембранах Viscoll с включением как первичных фибробластов, так и эпителиальных клеток человека.

Инженерная часть исследования. На полученной мМКО проведена серия научных экспериментов, направленных на исследование проницаемости и отработку режимов электрофизического воздействия на данный биологический барьер с сохранением его морфологической и функциональной целостности, а также обеспечения ускоренного прохождения дексаметазона через нее. Для ускоренного прохождения дексаметазона через мМКО электрофизическая установка инициировала направленный ионофорез отрицательного заряженных молекул дексаметазона параллельно с электропорацией мембран клеток в составе образца. После воздействия проводилась оценка остаточной жизнеспособности мМКО при помощи гистохимической окраски кальцеином и пропидий йодидом. Изменение концентрации дексаметазона после прохождения мМКО оценивали с использованием высокочувствительного хроматографа.

Заключение. В ходе оптимизации протокола получения мМКО и отбора подходящих компонентов подложки и клеточного материала было решено остановиться на модели, построенной на тонкой коллагеновой мембране Viscoll в качестве подложки, а также на первичных дермальных фибробластах человека и эпителиальных клетках линии HaCaT в качестве клеточного материала. Полученные экспериментальные образцы мМКО представляют собой полунепроницаемую мембрану с живыми клетками на поверхности и являются альтернативным аналогом нативной структуры, поскольку воспроизводят ее геометрические и морфофункциональные характеристики.

Помимо этого, продемонстрирован способ применения мМКО для доклинических исследований электрофизических установок, обеспечивающих ускоренное прохождение через нее целевых веществ при помощи электропоративного и ионофоретического воздействия.

Соснов А.В., Иванов Р.В., Балакин К.В., Шоболов Д.Л., Федотов Ю.А., Калмыков Ю.М. Разработка систем доставки лекарственных средств с применением микро- и наночастиц. Качественная клиническая практика 2008; 2: 4–12.
Kalia Y.N., Naik A., Garrison J., Guy R.H. Iontophoretic drug delivery. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56(5): 619–658, https://doi.org/10.1016/j.addr.2003.10.026.
Guy R.H., Kalia Y.N., Delgado-Charro M.B., Merino V., López A., Marro D. Iontophoresis: electrorepulsion and electroosmosis. J Control Release 2000; 64(1–3): 129–132, https://doi.org/10.1016/s0168-3659(99)00132-7.
Kalaria D.R., Singhal M., Patravale V., Merino V., Kalia Y.N. Simultaneous controlled iontophoretic delivery of pramipexole and rasagiline in vitro and in vivo: transdermal polypharmacy to treat Parkinson’s disease. Eur J Pharm Biopharm 2018; 127: 204–212, https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.02.031.
Adunka O., Unkelbach M.H., Mack M., Hambek M., Gstoettner W., Kiefer J. Cochlear implantation via the round window membrane minimizes trauma to cochlear structures: a histologically controlled insertion study. Acta Otolaryngol 2004; 124(7): 807–812, https://doi.org/10.1080/00016480410018179.
Brightman F.A., Leahy D.E., Searle G.E., Thomas S. Application of a generic physiologically based pharmacokinetic model to the estimation of xenobiotic levels in human plasma. Drug Metab Dispos 2006; 34(1): 94–101, https://doi.org/10.1124/dmd.105.004838.
Jones H.M., Gardner I.B., Collard W.T., Stanley P.J., Oxley P., Hosea N.A., Plowchalk D., Gernhardt S., Lin J., Dickins M., Rahavendran S.R., Jones B.C., Watson K.J., Pertinez H., Kumar V., Cole S. Simulation of human intravenous and oral pharmacokinetics of 21 diverse compounds using physiologically based pharmacokinetic modelling. Clin Pharmacokinet 2011; 50(5): 331–347, https://doi.org/10.2165/11539680-000000000-00000.
De Buck S.S., Sinha V.K., Fenu L.A., Nijsen M.J., Mackie C.E., Gilissen R.A. Prediction of human pharmacokinetics using physiologically based modeling: a retrospective analysis of 26 clinically tested drugs. Drug Metab Dispos 2007; 35(10): 1766–1780, https://doi.org/10.1124/dmd.107.015644.
Goycoolea M.V. Clinical aspects of round window membrane permeability under normal and pathological conditions. Acta Otolaryngol 2001; 121(4): 437–447, https://doi.org/10.1080/000164801300366552.
Carpenter A.M., Muchow D., Goycoolea M.V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1989; 115(5): 585–590, https://doi.org/10.1001/archotol.1989.01860290043012.
Camelliti P., Borg T.K., Kohl P. Structural and functional characterisation of cardiac fibroblasts. Cardiovasc Res 2005; 65(1): 40–51, https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2004.08.020.
Camelliti P., Green C.R., LeGrice I., Kohl P. Fibroblast network in rabbit sinoatrial node: structural and functional identification of homogeneous and heterogeneous cell coupling. Circ Res 2004; 94(6): 828–835, https://doi.org/10.1161/01.RES.0000122382.19400.14.
Baudino T.A., Carver W., Giles W., Borg T.K. Cardiac fibroblasts: friend or foe? Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006; 291(3): H1015–H1026, https://doi.org/10.1152/ajpheart.00023.2006.
Gabbiani G. The cellular derivation and the life span of the myofibroblast. Pathol Res Pract 1996; 192(7): 708–711, https://doi.org/10.1016/S0344-0338(96)80092-6.
Hinz B., Phan S.H., Thannickal V.J., Galli A., Bochaton-Piallat M.L., Gabbiani G. The myofibroblast: one function, multiple origins. Am J Pathol 2007; 170(6): 1807–1816, https://doi.org/10.2353/ajpath.2007.070112.
Georges P.C., Hui J.J., Gombos Z., McCormick M.E., Wang A.Y., Uemura M., Mick R., Janmey P.A., Furth E.E., Wells R.G. Increased stiffness of the rat liver precedes matrix deposition: implications for fibrosis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 293(6): G1147–G1154, https://doi.org/10.1152/ajpgi.00032.2007.
Humphrey J.D., Dufresne E.R., Schwartz M.A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol 2014; 15(12): 802–812, https://doi.org/10.1038/nrm3896.
Wang Q., Chiang E.T., Lim M., Lai J., Rogers R., Janmey P.A., Shepro D., Doerschuk C.M. Changes in the biomechanical properties of neutrophils and endothelial cells during adhesion. Blood 2001; 97(3): 660–668, https://doi.org/10.1182/blood.v97.3.660.
Leung L.Y., Tian D., Brangwynne C.P., Weitz D.A., Tschumperlin D.J. A new microrheometric approach reveals individual and cooperative roles for TGF-beta1 and IL-1beta in fibroblast-mediated stiffening of collagen gels. FASEB J 2007; 21(9): 2064–2073, https://doi.org/10.1096/fj.06-7510com.
Richardson T.L., Ishiyama E., Keels E.W. Submicroscopic studies of the round window membrane. Acta Otolaryngol 1971; 71(1): 9–21, https://doi.org/10.3109/00016487109125327.
Miriszlai E., Benedeczky I., Csapó S., Bodánszky H. The ultrastructure of the round window membrane of the cat. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1978; 40(2): 111–119, https://doi.org/10.1159/000275393.
Mao-li D., Zhi-qiang C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology 2009; 4(1): 34–43, https://doi.org/10.1016/S1672-2930(09)50006-2.
Lundman L.A., Holmquist L., Bagger-Sjöbäck D. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol 1987; 104(5–6): 472–480, https://doi.org/10.3109/00016488709128277.
Gan R.Z., Nakmali D., Zhang X. Dynamic properties of round window membrane in guinea pig otitis media model measured with electromagnetic stimulation. Hear Res 2013; 301: 125–136, https://doi.org/10.1016/j.heares.2013.01.001.
Keskin Yılmaz N., Albasan H., Börkü M.K., Paparella M.M., Cüreoğlu S. Three-dimensional analysis of round window membrane in the chinchilla model with acute otitis media induced with streptococcus pneumoniae 7F. Turk Arch Otorhinolaryngol 2021; 59(1): 43–48, https://doi.org/10.4274/tao.2021.5998.
Han S., Suzuki-Kerr H., Suwantika M., Telang R.S., Gerneke D.A., Anekal P.V., Bird P., Vlajkovic S.M., Thorne P.R. Characterization of the sheep round window membrane. J Assoc Res Otolaryngol 2021; 22(1): 1–17, https://doi.org/10.1007/s10162-020-00778-9.
Nomura Y., Tanaka T., Kobayashi H., Kimura Y., Soejima Y., Sawabe M. A 3-dimensional model of the human round window membrane. Ann Otol Rhinol Laryngol 2019; 128(6_suppl): 103S–110S, https://doi.org/10.1177/0003489419833406.
Goycoolea M.V., Lundman L. Round window membrane. Structure function and permeability: a review. Microsc Res Tech 1997; 36(3): 201–211, https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0029(19970201)36:3<201::AID-JEMT8>3.0.CO;2-R.
Роговая О.С., Зупник А.О., Измайлова Л.Ш., Воротеляк Е.А. Морфофункциональная характеристика фибробластов папиллярного и ретикулярного слоев дермы кожи человека. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология 2021; 76(4): 250–257.
Воеводин В.В., Воротеляк Е.А., Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Мищенко В.В., Небогаткин С.В., Роговая О.С., Романов К.И., Рябинин А.А., Хомич В.Ю., Шершунова Е.А. Использование электрофизической установки для импульсного воздействия на биологические мембраны и оценка их жизнеспособности. Прикладная физика 2024; 2: 1.
Boehnke K., Mirancea N., Pavesio A., Fusenig N.E., Boukamp P., Stark H.J. Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents. Eur J Cell Biol 2007; 86(11–12): 731–746, https://doi.org/10.1016/j.ejcb.2006.12.005.
Rogovaya O.S., Abolin D.S., Cherkashina O.L., Smyslov A.D., Vorotelyak E.A., Kalabusheva E.P. In vitro and in vivo evaluation of antifibrotic properties of verteporfin in a composition of a collagen scaffold. Biochemistry (Mosc) 2024; 89(5): 942–957, https://doi.org/10.1134/S0006297924050146.
Sun J.J., Liu Y., Kong W.J., Jiang P., Jiang W. In vitro permeability of round window membrane to transforming dexamethasone with delivery vehicles — a dosage estimation. Chin Med J (Engl) 2007; 120(24): 2284–2289.

Riabinin A.A., Rogovaya O.S., Kryukov A.I., Kunelskaya N.L., Yanyushkina E.S., Mischenko V.V., Ilyin M.M., Shershunova E.A., Voyevodin V.V., Nebogatkin S.V., Pomanov K.I., Vorotelyak E.A. The Development of Inner Ear Membrane Analogues for Experimental Otorhinolaryngology. Sovremennye tehnologii v medicine 2025; 17(3): 5, https://doi.org/10.17691/stm2025.17.3.01